Del gen a la proteína (Parte 1) PDF

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Trabajo tutorado sobre la Insulina: historia, biosíntesis y tipos de insulina...

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1. DEL GEN A LA PROTEÍNA 1.1. HISTORIA El descubrimiento de la insulina está muy ligado a la historia de la enfermedad de la diabetes la cual fue descrita por primera vez alrededor del año 70 D.C por un médico griego: “El enfermo orina incesantemente. Cuando la enfermedad está establecida la vida es corta y desagradable. La sed es insaciable… La enfermedad es un sifón que vacía el organismo”1. Y precisamente diabetes significa “sifón” en griego. Otro de los aspectos más característicos de los enfermos de diabetes es el sabor dulce de su orina, por eso, posteriormente, se añadió el término “mellitus” que significa miel en latín. Más adelante, ya en el siglo XIX, el hecho más relevante fue el descubrimiento de los islotes de Langerhans, donde se encuentran las células β del páncreas. Diversos experimentos e investigaciones permitieron conocer que estas eran las células encargadas de la secreción de la insulina, el péptido que permite que la glucosa de la sangre pueda ser absorbida por las células del hígado, de los músculos y los adipocitos y que sea almacenada en forma de glucógeno. De manera que, si hay un déficit de insulina, aumentarán los niveles de glucemia, dando lugar a todos los síntomas ya descritos al principio. Entrados pues en el siglo XX, esto supuso un gran avance en la historia de la Medicina, dado que se consiguió encontrar la causa de la enfermedad: la falta de insulina en el organismo. La importancia del hallazgo es significativa, atendiendo al hecho de que entre un 2% y un 5% de la población sufría diabetes mellitus. 1.2. ESTRUCTURA La insulina es una hormona, concretamente un polipéptido que se pliega como una proteína globular típica: residuos hidrofóbicos sepultados en el interior que la molécula y los hidrofílicos en la superficie, estableciendo el máximo número de interacciones débiles posibles (también covalentes como los puentes de sulfuro) y disminuir así la energía libre de Gibbs. De esta manera quedará estabilizada la conformación nativa de la insulina. Más en detalle, la molécula está compuesta por dos cadenas de aminoácidos, la cadena A (de 21 aminoácidos) y la B (de 30) que quedan unidas mediante puentes disulfuro entre residuos de cisteína. Por lo que respecta a la estructura secundaria de ambas cadenas predomina la hélice α; a parte cabe destacar el puente disulfuro entre dos cisteínas de la misma cadena A y una lámina β formada por tres aminoácidos de la cadena B. Además, existe un punto de unión al ion zinc en la histidina de la posición 10 de la cadena B. En cuanto a la estructura terciaria tridimensional global de la insulina es necesario comentar la existencia de tres estados conformacionales en los que el polipéptido es estable. Hablamos de una forma R (relajada), una forma T (tensa) y una mezcla de las dos (Rf). La variedad estructural es debida a la flexibilidad del extremo N-terminal de la cadena B, que permite la formación de una hélice muy largada en la forma R y otra más corta en T. En esta última quedarán, por tanto, residuos sin una estructura secundaria definida Finalmente, respecto a la estructura de la insulina faltaría por nombrar la asociación de varios monómeros de insulina en forma hexámeros, los cuales son almacenados en vesículas que serán secretadas. Esta unión de seis moléculas de insulina facilita el almacenamiento y las protege de la acción de proteasas. Dado que cada insulina por separado puede encontrarse en uno de los tres estados conformacionales (R, T o Rf), estas asociaciones podrán dar lugar a múltiples tipos diferentes de hexámeros. Los más estudiados son los

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(Fragmento de La insulina: de la biología a la patología molecular , pág 18)

todo tenso, los todo relajado o los mitad tenso - mitad relajada. No obstante, en todos ellos están presentes átomos de sodio y de zinc: -

Sodio: se halla en el centro del complejo, entre las seis subunidades. En concreto, son tres átomos de Na en total que interaccionan con residuos de glutamato de las cadenas B de la insulina.

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Zinc: átomos también centrales que establecen conexión con los sitios de unión para el zinc (histidina) de las cadenas B, ya nombrados anteriormente. Además, están enlazados con átomos de cloro.

Las interacciones que se establecen con estos átomos metálicos, sobretodo con el zinc, estabilizan la estructura del hexámero y mantiene unidas cada una de las seis unidades de insulina. Hay que destacar que sólo es funcional el monómero de insulina, por lo que cuando este complejo sea liberado al torrente sanguíneo deberá disociarse. 1.3. CODIFICACIÓN GENÉTICA El gen de la insulina contiene la información genética necesaria para sintetizar una molécula precursora de la insulina, es decir, la transcripción y traducción no dará lugar a la hormona en su conformación final funcional sino a lo que conocemos como preproinsulina. Se trata de una única cadena polipeptídica que experimentará modificaciones post-traduccionales para dar lugar al producto final. El gen del que estamos hablando es el gen INS, que consiste en tres exones y dos intrones localizados en el brazo corto del cromosoma 11. Está formado por 1430 pares de bases y el primer exón contiene exclusivamente la información para iniciar la trascripción. Los otros dos exones codifican la cadena A y B de la insulina, así como el péptido señal y otra cadena C que sólo están presentes en la preproinsulina. Los intrones quedarán localizados entre los exones; por tanto, la representación esquemática del gen sería la siguiente:

Figura 4: intrones (I) y exones (E). El primer exón (E1) presenta bases de inicio de la transcripción mientras que el segundo (E2) codifica para el péptido señal (P), la cadena B y parte de la cadena C. El último exón (E3) codifica el resto de la cadena C y la cadena A, presenta bases en el extremo de final de la transcripción.

Se trata de un gen muy bien conservado entre especies debido a la importancia de la insulina de forma que, por ejemplo, en el cariotipo del cerdo encontramos un gen que permite la síntesis de una insulina casi idéntica a la humana, solamente se diferencia en un residuo aminoacídico. La glucemia es el principal regulador de la expresión del gen INS, un aumento en los niveles puede dar lugar a una serie de procesos mediados por mensajeros secundarios y factores de transcripción que estimulan la síntesis de insulina. Todo esto implica que se hayan puesto en marcha los mecanismos de transducción de señales, la transcripción y la traducción en los que participan muchas moléculas. Así pues, el proceso de síntesis puede llegar a durar hasta 1 hora. También es importante a nivel clínico la investigación de este gen en determinadas patologías en las que se encuentra “inhibido”. Además de la diabetes, de la que se hablará más adelante, podemos nombrar el caso del Alzheimer. En pacientes con esta enfermedad se ha observado una estrecha relación con el déficit de insulina y la escasa expresión del gen, lo que podría significar una mayor predisposición a sufrir la patología si previamente la persona es diabética.

1.4. BIOSÍNTESIS DE LA INSULINA La biosíntesis de la insulina se ejecuta a partir de la transcripción – traducción del Gen INS, donde en primer lugar se sintetizará como una preprohormona que tras diversos procesos enzimáticos dará lugar a una molécula biológicamente activa. Esta biosíntesis comienza en los ribosomas acoplados al retículo endoplasmático rugoso de las células beta de los islotes de Langerhans dando lugar a la preproinsulina, el primer precursor inactivo de la insulina. Se trata de un polipéptido que tiene un peso molecular aproximado de 11.500 y que está compuesto por unos 110 aminoácidos. Si se trata en profundidad se pueden diferenciar cuatro fragmentos distintos que lo conforma; un péptido señal (24 aminoácidos), la cadena B, el péptido conector (péptido C) y la cadena A. Gracias al péptido señal que contiene dicha proteína, esta es capaz de dirigirse desde los ribosomas hasta el retículo endoplasmático rugoso. La transferencia de la preproinsulina al retículo endoplasmático rugoso se debe a la formación de un complejo proteína – ribosoma, que, a su vez, es activado por una partícula de reconocimiento citosólica (SRP). Seguidamente, la preproinsulina se desdobla por la acción de una peptidasa, perdiendo así, el péptido señal y reduciéndose a 83 aminoácidos. Se corresponde a un polipéptido con un peso molecular cercano a los 9.000, de cadena única en espiral, es decir, con la conformación nativa ya adoptada y formando el segundo precursor, todavía inactivo, la proinsulina. La proinsulina se traslada a través de las vesículas desde el retículo endoplasmático rugoso hasta el complejo de Golgi. Finalmente, en el complejo de Golgi tras un proceso de maduración, la proinsulina será escindida por enzimas proteolíticas, dando lugar a la insulina, como hormona ya activa de 51 aminoácidos, y a un péptido C de 32 aminoácidos (péptido conector). Realmente, el resultado final se consigue gracias a la acción continua de la prohormona convertasa 1, la prohormona convertasa 2, la exoproteasa carboxipeptidasa E y la endopeptidasa del péptido C. La acción de dichas moléculas provoca la liberación del péptido C de la proinsulina, que genera que los extremos C – terminal y N – terminal queden libres y de como resultado a la insulina, formada por la cadena A de 21 aminoácidos y la cadena B de 30 aminoácidos, unidos entre sí por puentes disulfuro. Consecutivamente, la insulina y el péptido C resultantes de este último proceso se empaquetan rápidamente en gránulos de secreción que están ligados al complejo de Golgi en el citoplasma. Asimismo, para que el almacenamiento sea más estable y maduro se necesitará de la presencia de Zinc, que provoca que la insulina se organice en hexámeros, aunque su forma activa es el monómero. Los gránulos que contienen las moléculas en cuestión en cantidades equimolares, serán segregadas al plasma sanguíneo por exocitosis gracias a la acción de distintos iones, como el calcio (activador de microtúbulos), el potasio y el zinc. Aproximadamente 5 – 10 % del producto final secretado continua en forma de proinsulina. La proinsulina y el péptido C carecen de actividad insulínica, aunque, el péptido C es capaz unirse a receptores de membrana asociados a proteínas G, y así, desencadenar la activación de mínimo dos sistemas enzimáticos y regularlos, la sodio – potasio – adenosina trifosfatasa y la óxido nítrico sintasa endotelial. Pero, sin embargo, la actuación del péptido C sobre estas enzimas sigue siendo ambiguo. Kawasaki E. ZnT8 and type 1 diabetes. Endocrine Journal. 2012 ;59(7):531-537. DOI: 10.1507/endocrj.ej12-0069

1.5. LOS DIFERENTES TIPOS DE INSULINA Y LOS EFECTOS DE LAS MODIFICACIONES INTRODUCIDAS SOBRE LA INSULINA NATIVA La secreción de la insulina se conforma entorno a dos componentes fundamentales, un componente basal continuo y un componente agudo desencadenado por la hiperglucemia. Además, la insulina humana manifiesta una absorción excesivamente lenta, debido a su asociación en dímeros y hexámeros, siendo su forma activa el monómero. Por otra parte, la hormona polipeptídica en cuestión consta de tres características fundamentales: el tiempo de inicio, el pico de acción máxima y la duración de su actividad. •

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El tiempo de inicio es el periodo que transcurre desde la inyección de la insulina hasta que esta accede al torrente sanguíneo y los niveles de glucosa empiezan a descender. Este periodo comienza a manifestarse entre 30 a 60 minutos. El pico de acción máxima es la etapa en la que la insulina alcanza su máxima actividad y potencial en proporción con decrecimiento de la glucosa en el torrente sanguíneo. Este periodo se presenta entre 2 a 4 horas. La duración de su actividad es la duración en la que la insulina sigue reduciendo los niveles de glucosa en sangre. Esta duración permanece durante 5 o 7 horas.

Por otro lado, el objetivo de los tratamientos insulínicos no es otro que el de ocasionar un efecto metabólico análogo al efecto que produce la secreción de insulina endógena. En el pasado, la diabetes se trataba con insulina bovina y con insulina porcina, por su gran parecido a la insulina humana, sin embargo, no lograron los aspectos fundamentales para mantener las glucemias próximas a la normalidad. Pero en la actualidad, es posible sintetizar insulina humana biosintética gracias a las técnicas de ADN recombinante, las cuales, mediante alteraciones en la secuencia de aminoácidos, han desarrollado los denominados “antígenos de la insulina”, capaces de actuar igual que la insulina endógena. Realmente, el efecto de estas modificaciones en la secuencia de aminoácidos difiere en la velocidad de absorción de la insulina. Existen los análogos de acción rápida y los de acción basal. Los análogos de acción rápida se absorben con una mayor facilidad al tener menos a organizarse en hexámeros, por lo que su acción será más rápida, al igual que su pico de acción máxima será más prominente y su degradación será precipitada. En cuanto a sus características, cabe destacar que tras la inyección comienza a surtir efecto entre los 5 y 15 minutos, su pico máximo de acción da lugar entre los 60 y 120 minutos, y tiene una duración de 2 a 4 horas. En resumen, estos análogos tienen absorción el doble de rápido que la insulina humana regular, por lo que, su acción es el doble de eficaz y su duración es más corta. Dos análogos de acción rápida son la insulina aspart y la insulina lispro. En los extremos carboxilos de la cadena B en la insulina lispro los residuos 28 y 29 (lisina y prolina) han sido invertidos, mientras que, en la insulina aspart la prolina, ubicada en el residuo 28 de la cadena B, ha sido sustituida por un ácido aspártico. Los análogos de acción basal (acción lenta) son capaces de producir una liberación ralentizada de la insulina, lo que no provoca picos y evita así posibles hipoglucemias nocturnas. Su duración de su acción oscila entre las 20 y 24 horas. Dos ejemplos de análogos de la insulina de acción lenta son la insulina glargina y la insulina detemir. La insulina glargina se produce añadiendo a la insulina humana 2 arginas en su extremo carboxilo terminal de la cadena B y sustituyendo en la cadena A, en la posición A21, la asparagina por glicina. Por otro lado, la insulina detemir es un análogo soluble de la insulina retardada, donde se le suprime uno de sus aminoácidos y se añade el ácido mirístico, un ácido graso. Gracias al ácido mirístico, la insulina es capaz de unirse, de manera reversible, a los receptores de ácidos grasos presente en las albúminas. Esta unión permite que se ralentice su absorción y se prolongue su duración.

Por otra parte, también podemos añadir otros tipos de insulina: la insulina de acción breve, insulina de acción intermedia e insulina de fórmulas premezcladas. La insulina de acción breve es, generalmente, la insulina humana regular sin ninguna modificación, de la cual ya se comentaron sus características con anterioridad. Asimismo, en la insulina de acción intermedia destaca la insulina NPH (protamina neutra de Hagedorn), donde la insulina humana normal ha sido modificada añadiéndole protamina (proteína de pescado) a su secuencia de aminoácidos que, como consecuencia, provoca un retraso en su absorción y su duración es de aproximadamente de 10 a 13 horas. No obstante, también se han desarrollado otras insulinas mezclando dos análogos de acción rápida con un análogo de acción más lenta, dando lugar a la insulina de fórmulas premezcladas. Estas están constituidas por un 30% de insulina regular y un 70% de insulina NPH....