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Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Naturwissenschaftliche Fakultät I Institut für Biologie/Mikrobiologie

Praktikum „Biologie der Mikroorganismen“ Praktikumsabschnitt: Diauxie „Zweiphasiges Wachstum von chemotrophen Mikroorganismen von zwei verschiedenen Energiequellen am Beispiel von Escherichia coli“

Praktikumsleiter: Dr. Marco Fischer

Versuchsteilnehmer: Oskar Ahrens Simon Wogram Natalie Schlüter

1. Einleitung Diauxie bezeichnet ein zweiphasiges Wachstum von Mikroorganismen beim Vorhandensein von zwei verschiedenen Substraten, welche jedoch nicht gleichzeitig genutzt werden können. Das besser verwertbare Substrat wird vorerst genutzt und die Verwertung des zweiten Substrats solange unterdrückt, bis das erste vollständig aufgebraucht ist („Diauxie“, 2001). In dem Experiment wird zunächst Glucose in der ersten exponentiellen Phase verwertet und nach vollständigem Verbrauch die Enzyme für Lactose-Verwertung induziert. In dieser Zwischenzeit gibt es eine Wachstumsverzögerung der Bakterien, welche lag-Phase genannt wird. Während der zweiten exponentiellen Phase wird Lactose mit einer längeren Verdopplungszeit verwertet (Madigan, Martinko, Stahl & Clark, 2013). Auf physiologischer Ebene wird die Diauxie durch die Katabolitrepression bedingt: Glucose ist das Substrat welches das schnellste Wachstum ermöglicht, und bewirkt eine Repression der Bildung derjenigen Enzyme, die zum Abbau des zweiten Substrats benötigt werden. Zur Erstellung einer Wachstumskurve sollen im Versuch das Wachstum von Escherichia coli unter Verwendung von Glucose sowie Glucose und Lactose als Kohlenstoff- und Energiequelle analysieren, in dem periodisch die Optische Dichte der Flüssigkulturen bestimmt wird. ß-Galactosidase spaltet Lactose in Glucose und Galaktose und ist somit ein essentielles Enzym der Lactose-Verwertung. Um die ßGalactosidase-Aktivität messen zu können wird die synthetische Verbindung σ-Nitrophenyl-βGalactosid (ONPG) hinzugegeben. Dieses wird wie Lactose durch die Galactosid-Permease in die Zelle transportiert und durch die β-Galactosidase zu Galactose (farblos) und σ-Nitrophenol (gelb) hydrolysiert („beta-Galactosidase“, 1999). Dabei beträgt die Rate der Reaktion 1 nMol ONPG pro Minute. Nach Abbruch der Reaktion mittels 1 M Na 2CO3-Lösung wird die Extinktion photometrisch bei einer Wellenlänge von 420 nm ermittelt. Die spezifische Enzymaktivität wird mit folgender Formel berechnet: U =

1000× A 420 und in Miller-Units ausgegeben (Skript). Zudem soll mithilfe t × v × OD 550

der Bindung von spezifischen Antikörpern das Enzym ß-Galactosidase nachgewiesen werden. Hierfür wurden im Experiment vorerst Proteine mittels SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch Western-Blot auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Im Anschluss wird diese mit einem primären Antikörper inkubiert , welcher an die ß-Galactosidase bindet und von einem IgG HRPKonjugat (sekundärer Antikörper) enzymatisch detektiert. Mittels Chemilumineszenz-Imager wird der Blot bzw. die Membran auf ß-Galactosidase untersucht (Skript).

2. Durchführung Siehe Skript.

3. Material und Methoden Siehe Skript.

4. Ergebnisse Die Hauptkulturen wurden zur Inkubation (bei 37°C) in einen Rotationsschüttler gegeben und nach 30 Minuten jeweils die OD550 bestimmt, nur der Zeitpunkt 1 wurde nach 45 Minuten ermittelt (Tab. 3, s. Anhang). Anhand dieser Daten wurden vier Wachstumskurven erstellt (Abb. 1) und aus diesen die Wachstumsrate und Verdopplungszeit berechnet. Glucose [A] Miller-Units [A] Lineare Regression

A

Glucose [C] Miller-Units [C] Linaere Regression

C

100

20 18

90

70

14 12

OD (550)

OD (550)

80

Miller-Units [U]

0,13534

10 8

Miller-Units [U]

16

0,13534

6

60

4 2

50

0

0

50

100

150

200

250

300

0

350

50

100

Zeit [Min]

150

200

250

300

Zeit [Min] Glucose + Lactose [B] Miller-Units [B] Lineare Regression

B

Glucose + Lactose [D] Miller-Units [D] Lineare Regression

D

12000

12000

8000

8000

6000 0,04979 4000

0,13534

6000

4000

2000

2000

0,01832

0

0 0

50

100

150

200

250

300

350

Zeit [Min]

0

50

100

150

200

250

Zeit [Min]

Abb. 1: Wachstumskurven der Hauptkulturen A-D, welche mit E. coli angeimpft worden sind und die β-Galactosidase Aktivität in Miller-Units. Alle 30 Minuten wurde die OD bei 550 nm gemessen und die Extinktion Halblogarithmisch aufgetragen. A: Zeigt die Extinktion und Aktivität der Hauptkultur A an, welche nur Glucose im Medium beinhaltet. Die log-Phase beginnt bei Minute 0 und Endet bei Minute 75. B: Zeigt die Extinktion und Aktivität der Hauptkultur B an, welche Glucose und Lactose im Medium beinhaltet. Zu erkennen ist das zweiphasige Wachstum anhand der beiden log-Phasen und einer lag-Phase von Minute 45 bis Minute 105. C: Zeigt die Extinktion und Aktivität der Hauptkultur C an, welche nur Glucose im Medium beinhaltet. Die log-Phase beginnt bei Minute 0 und Endet bei Minute 105. A: Zeigt die Extinktion und Aktivität der Hauptkultur D an, welche Glucose und Lactose im Medium beinhaltet. Zu erkennen ist das zweiphasige Wachstum anhand der beiden log-Phasen und einer lag-Phase bei Minute 105.

Berechnung der Wachstumsrate μ:

−1

μ(h )=

ln (0,1)−ln (0,059 ) −1 =0,704 h 0,75 h−0 h ln (0,094 )−ln (0,055 ) −1 μ[ B log(1) ]= =0,621 h 0,75 h−0 h μ[ A ]=

ln (x t )− ln(x 0) t−t0 ln (0,096)−ln (0,055 ) −1 =0,446 h ; μ[ C]= 1,25 h−0 h ln(0,116)− ln (0,06 ) −1 =0,527 h ; μ[ D log(1) ]= 1,25 h−0 h

300

Miller-Units [U]

10000

OD (550)

0,13534

10000

Miller-Units [U]

Glucose + Lactose [OD]

0,36788

μ[ B log(2) ]=

ln (0,252)−ln (0,102) −1 =0,362 h 5,25 h−2,75 h

; μ[ D log( 2 ) ]=

ln (0,318)−ln (0,176 ) −1 =0,394 h 4,25 h−2,75 h

Berechnung der Verdopplungszeit td:

ln (2) ln (2) ln (2) ln (2) =1,67 h ; t d [ C]= =1,87 h = = −1 −1 μ μ 0,414 h 0,37 h ln (2) ln (2) ln (2) ln (2) =1,68 h ; t d [ Dlog(1) ]= =1,32 h = = t d [ B log( 1) ]= −1 −1 μ μ 0,412h 0,527 h ln (2) ln (2) ln(2) ln(2) = = t d [ B log(2) ]= =1,76 h =1,91 h ; t d [ D log(2) ]= −1 −1 μ μ 0,362h 0,394 h t d [ A ]=

Bei Verwendung von Glucose, statt der Verwertung von Lactose, ist die Wachstumsrate im Durchschnitt 1,5-mal höher und die Verdopplungszeit um 34 Minuten verringert. In der Wachstumskurve (Abb. 1) kann man dazu eine Verringerung der Extinktion nach vollständiger Verwertung der Glucose erkennen. Beispielsweise verringert sich die Extinktion der Kultur B von 0,092 (Minute 75) auf 0,08 (Minute 105), da die Enzyme zum Lactoseabbau erst synthetisiert werden müssen (lag-Phase). Auch die unterschiedlichen Konzentrationen an Glucose zeigen eine Änderung der Wachstumsrate und Verdopplungszeit auf. Eine Steigerung der Glucosekonzentration um Faktor 0,6 ergibt in Bezug auf die Zeit der Verdopplungen eine Verringerung von 22 Minuten (Tab. 1). Tab.1: Konzentration der Glucose und Lactose in den Hauptkulturen A-D, sowie der Vergleich der Verdopplungszeit und der Wachstunsrate

A

B

C

0,15 %

0,15 %

Lactoselösung

-

μ

-1

Log(1) : 0,621 h Log(2) : 0,362 h-1

1,67 h

Log(1) : 1,68 h Log(2) : 1,91 h

Glucoselösung

td

0,704 h

D 0,25 %

0,25 %

0,3 %

-

0,3 %

-1

-1

Log(1) : 0,527 h-1 Log(2) : 0,394 h-1

1,87 h

Log(1) : 1,32 h Log(2) : 1,76 h

0,446 h

Die Kulturen B und D besitzen durch durch das Vorhandensein von Glucose und Lactose ein zweiphasiges Wachstum, wodurch es zwei Werte in der Spalte Wachstumsrate μ und Verdopplungszeit td gibt.

Als zweites wurde die

ß-Galactosidase-Aktivität der Hauptkulturen mittels ONPG und

photometrischer Messung bestimmt. In Tabelle 2 kann man erkennen, dass die Aktivität in den Hauptkulturen A und D, welche nur Glucose enthielten, einen Mittelwert von 69 (Kultur A) und 8 (Kultur C) aufwiesen. Die Hauptkulturen B und D weisen einen maximal Wert von 10.573 (Kultur B) und 10.967 (Kultur D) auf und sind somit im Vergleich von Kultur B : Kultur A 36-mal höher. Dies liegt vor allem an der Verwertung von Lactose, wodurch die Aktivität der ß-Galactosidase steigt, da diese Lactose in Galactose und Glucose spaltet, um sie in die Glykolyse einzuschleusen. Ein Vergleich der Wachstumskurve mit der jeweiligen ß-Galactosidase-Aktivität zeigt, dass trotz Schwankungen der Kultur A, eine gewisse Parallelität der Steigungen zu erkennen ist. Besonders

die Minuten 0 bis 75 zeigen dies auf, in der die OD von 0,059 auf 0,099 steigt und auch die MillerUnits einen Anstieg von 42 Einheiten aufzeigen (Abb. 1-A). Kultur C weißt diese Parallelität nicht auf und auch die ß-Galactosidase-Aktivität zeigt größere Schwankungen mit einem Höchstwert von 17 Miller-Units, zum Vergleich, der Höchstwert der Kultur A betrug 93 Einheiten (Abb. 1-C). Ein fast exponentieller Anstieg der Aktivität der ß-Galactosidase konnte bei Kultur B gefunden werden, hier war ein stetiger Anstieg der Miller-Units zu verzeichnen, der sich auch während der lag-Phase fortführte (Abb. 1-B). Im Vergleich dazu besaß Kultur D eine höhere Glucosekonzentration und es ist zu erkennen das die Steigerung an Miller-Units in den ersten 150 Minuten 11-mal höher war als bei Kultur B. Jedoch ist ein kurzer Abfall um 1.000 Einheiten bei Minute 195 und um 300 Einheiten bei Minute 225 zu 255 zu beobachten. Tab.2: Aktivität der ß-Galactosidase in Miller-Units

Zeit (min)

A

B

C

D

Glucose

Glucose + Lactose

Glucose

Glucose + Lactose

0

51

73

0

17

45

59

73

0

8

75

93

118

8

92

105

68

373

17

1.625

135

76

582

8

5.583

165

76

1.782

8

8.133

195

59

2.655

17

7.200

225

68

4.127

8

11.200

255

68

4.709

8

10.967

285

76

10.573

-

-

Die Miller-Units wurden mit Hilfe der Formel: U = 1000 x A20 / (2 min x 1 ml x OD550 ) berechnet.

Abbildung 1.2: Fotos von den Ergebnissen des Proteinnachweises von Gruppe 1. A: Coomassiegefärbtes Polyacrylamidgel nach der SDS-PAGE gefärbt: In dem 10 % Polyacrylamid Trenngel wurden Proteine aus aufgeschlossenen Zellen aus den E. coli Flüssigkolonien C und D von Gruppe 1 aufgetrennt Anschließend wurde das Gel mittels Coomassie gefärbt. B: Nitrozellulosemembran: Das Foto wurde im Chemilumineszens-Imager aufgenommen nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid, Coumarinsäure und Luminol. Detektion durch den Unspezifischen Antikörper IgG HRP-Konjugat (anti-Kaninchen) und den Primären Antikörper gegen β-Galactosidase (aus Kaninchen). C: Coomassiegefärbtes Polyacrylamidgel nach dem semidry-Westernblot gefärbt. In dem 10 % Polyacrylamid Trenngel wurden Proteine aus aufgeschlossenen Zellen aus den E. coli Flüssigkolonien C und D aufgetrennt. Danach wurde das Gel für ein semidry-Westernblot genutzt und anschließend mittels Coomassie gefärbt. D: Nitrozellulosemembran nach der Amidoschwarzfärbung: Nach dem Chemilumineszenz Nachweis gefärbt zur Überprüfung der Membran. In den Spuren wurden die Proben die jeweils darüber stehen aufgetragen. Der Buchstabe steht für die Flüssigkolonie. C = Glukose und D = Glukose und Lactose. Die Zahl für die Zeit nach dem die Probe entnommen wurde: 1 = 45 min, 2 = 75 min, 3 = 105 min, 6 = 195 min, M Links = unstained Protein Molecular Weight Marker, M Rechts = prestained Protein Molecular Weight Marker

Abbildung 1.3: Fotos von den Ergebnissen des Proteinnachweises von Gruppe 2. A: Coomassiegefärbtes Polyacrylamidgel nach der SDS-PAGE gefärbt: In dem 10 % Polyacrylamid Trenngel wurden Proteine aus aufgeschlossenen Zellen aus den E. coli Flüssigkolonien A und B aufgetrennt Anschließend wurde das Gel mittels Coomassie gefärbt. B: Nitrozellulosemembran: Das Foto wurde im Chemilumineszens-Imager aufgenommen nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid, Coumarinsäure und Luminol. Detektion durch den Unspezifischen Antikörper IgG HRP-Konjugat (anti-Kaninchen ) und den Primären Antikörper gegen β-Galactosidase (aus Kaninchen ). C: Coomassiegefärbtes Polyacrylamidgel nach dem semidry-Westernblot gefärbt. In dem 10 % Polyacrylamid Trenngel wurden Proteine aus aufgeschlossenen Zellen aus den E. coli Flüssigkolonien A und B aufgetrennt. Danach wurde das Gel für ein semidry-Westernblot genutzt und anschließend mittels Coomassie gefärbt. D: Nitrozellulosemembran nach der Amidoschwarzfärbung: Nach dem Chemilumineszenz Nachweis gefärbt zur Überprüfung der Membran. In den Spuren wurden die Proben die jeweils darüber stehen aufgetragen. Der Buchstabe steht für die Flüssigkolonie. A = Glukose und B = Glukose und Lactose. Die Zahl für die Zeit nach dem die Probe entnommen wurde: 1 = 45 min, 3 = 105 min, 5 = 165 min, 7 = 225 min, M Links = unstained Protein Molecular Weight Marker, M Rechts = prestained Protein Molecular Weight Marker

Sowohl in Abbildung 1.2 als auch in 1.3 finden sich in Gel A der Größe nach aufgetrennte Proteine. In Abbildung 1.3 sind sie jedoch sehr schwer zu erkennen bzw. kaum sichtbar. Die Nachzuweisende β-Galactosidase ist ein 464 kDa großes Homotetramer. Die Untereinheiten haben eine Größe von 116 kDa. In keinem der Gele findet sich eine Bande die dieser Größe entsprechen würde. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die Menge an β-Galactosidase in dem Gel zu gering ist um durch Coomassie detektiert zu werden. Die Linke Spur M sollte den „unstained Protein Molecular Weight Marker“ enthalten. Dieser Marker wird erst durch eine unspezifische Proteinfärbemethode wie Coomassie sichtbar, findet sich allerdings in keinem der so gefärbten Gele. In Beiden Abbildungen 1.2 und 1.3 enthält das Gel A wesentlich weniger Proteine als das Gel C. Die Übertragung der Proteine mittels Western-Blot scheint erfolgreich zu sein. Die dadurch erhaltenen proteinbeladenen Nitrozellulosemembranen wurden mit Antikörpern behandelt und nach Zugabe der Chemilumineszenz Reagenzien im Chemilumineszenz-Imager die Position des sekundären Antikörpers visualisiert. In Abbildung 1.3 erkennt man etliche Signale die Positionen des Sekundären Antikörpers darstellen. Auffällig ist das die meisten nicht die Größe von 116 kDa der β-Galactosidase besitzen. Aufgrund der geordneten Bandenstruktur ist dies jedoch kein Fehler sondern ein Resultat der Funktionsweise von Antikörpern. Der Primäre Antikörper erkennt ein Epitop an der β-Galactosidase, welches sehr spezifisch für diese ist, jedoch können andere Proteine zufällig auch dasselbe oder ein ähnliches Epitop aufweisen, dass an die Antigen Bindungs-Region des Antikörpers bindet. So werden auch einige Proteine die ein ähnliches Epitop aufweisen vom primären und damit auch vom sekundären Antikörper erkannt. In Abbildung 1.2 B erkennt man bei ungefähr 116 kDa in den Spuren D1-D6 immer stärkere Signale. Wie bereits erläutert sind die Protein Proben aus verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums aus Flüssigkolonie C und D entnommen worden. So sind in Spur C1-C6 auf derselben Höhe keine Signale zu erkennen, da die Kolonie ohne Lactose gewachsen ist und demnach nur sehr geringe Mengen an β-Galactosidase enthält. Die Zeitpunkte in Spur D1-D6 sind nach der Induktion der βGalactosidase Synthese. Man erkennt wie sich die Menge an β-Galactosidase in der Kultur erhöht. In der Spur des linken Markers erkennt man auf Höhe der β-Galactosidase Signale, ebenfalls ein starkes Signal. Dies ist der Fall, da der „ unstained Protein Molecular Weight Marker “ die βGalactosidase enthält um 116 kDa

anzuzeigen. Diese wird natürlich durch die Antikörper

ebenfalls visualisiert. In Abbildung 1.3 B sind keine definierten Signale zu erkennen. Lediglich ein unsauberer Schmier ist zu Detektieren. In den Abbildungen 1.2 und 1.3 D ist die Nitrozellulosemembran, nach der Amidoschwarzfärbung, zu sehen. Auf beiden Membranen sind Proteine angefärbt worden, da man geregelt Banden erkennen kann. Interessanterweise ist in Abb. 1.3 der Membran D in Spur B7 eine zarte Bande von weniger als 130 kDa zu erkennen, welche eine Untereinheit der β-Galactosidase darstellen könnte. Auf Membran D in Abb. 1.2 befinden sich leider Flecken über der Stelle. Es wäre zu erwarten dass die Banden hier deutlicher sind da in Kultur D nach 165 min 8.133 Miller-Units während bei Kultur B nach 195 min nur 2.655 Miller-Units gemessen wurden (vgl. Tab. 2).

5. Diskussion Die Ergebnisse der verschiedenen Versuche sind wie erwartet. In Abb. 1 erkennt man das es nur bei den Kulturen die in Gegenwart von Lactose gewachsen sind auch zu einer hohen Aktivität der β-Galactosidase gekommen ist. Außerdem ist erst Aktivität messbar wenn die Kolonie in die LagPhase übergeht, da hier die Glucose aufgebraucht ist und aufgrund der Katabolitrepession erst jetzt das Lac-Operon in hohe Maß exprimiert werden kann. Während die Kolonien B und D in die zweite Exponentielle-Phase übergehen steigt die Enzymaktivität weiter an, da immer mehr βGalactosidase synthetisiert wird. Die Flüssigkultur C, die in einer höheren Glucose Konzentration gewachsen ist, ging erwartungsgemäß erst später als die Flüssigkultur A in die Lag-Phase. Gleichermaßen war die Induktion der β-Galactosidase Synthese in Flüssigkultur D schneller als in Flüssigkultur B. Die Lag-Phase findet sich in D zwischen dem dritten und vierten Datenpunkt, während in Kultur B diese schon nach dem zweiten Datenpunkt beginnt und erst der fünfte Datenpunkt zu Beginn der Exponentiellen-Phase liegt. Eine mögliche Erklärung dafür findet sich ebenfalls in der unterschiedlichen Glucosekonzentration der beiden Kulturen. In Kultur B, die zu Beginn eine Glucosekonzentration von 15 % hat, ist die Glucose wesentlich schneller aufgebraucht weshalb sie früher in die Lag-Phase übergeht. Kultur D hat zu Beginn eine Glucosekonzentration von 25 % und hat so Glucose länger zur Verfügung. Warum die Zellen in Kultur D danach so viel schneller in die Exponentielle-Phase übergehen ist uns nicht wirklich klar. Wenn man allerdings die Werte in Tabelle 2 betrachtet, so fällt auf das nach dem Datenpunkt bei 75 min die Miller Units Werte für Kultur D sich wesentlich stärker, als bei Kultur C, steigern. Die Zellen haben eventuell durch ihr Wachstum in der höheren Glucosekonzentration mehr Energie konserviert, die sie für eine wesentlich stärkere Synthese von β-Galactosidase nutzen können. Die Gele A und C zeigen das die Auftrennung und Färbung der Proteine mit Coomassie funktioniert hat und auch das der Western-Blot erfolgreich war. Jedoch findet sich bei beiden ...