Dispensa di Microbiologia Quantitativa- biotecnologie PDF

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Conte Microbiche A- Le diluizioni Le conte microbiche presentano sempre la necessità di operare apposite diluizioni della sospensione di partenza, detta anche tal quale e abbreviata t/q. Ogni diluizione è definita in maniera da spiegare quanta parte della sospensione di partenza vada diluita in quante parti del solvente, normalmente rappresentato da acqua o soluzione fisiologica, talvolta da terreno liquido o solidificabile allo stato fuso. Un caso molto comune è la diluizione 1:10 ovvero un volume di sospensione iniziale in 10 volumi finali. Tale diluizione si può definire anche con altre nomenclature quali: 1 + 9 o 10-1. • Secondo la prima nomenclatura (1:10) 1 è il volume del solvente e 10 è il volume finale, per cui la sospensione è stata diluita 10 volte. Queste 10 volte sono sinteticamente espresse come Fattore di Diluizione (FD), che è il parametro che ci indica quante volte sia stata diluita una sospensione. Il fattore di diluizione è il reciproco della diluizione. Tale nomenclatura può quindi essere indicata come 1:FD. • Nella seconda nomenclatura (1+9) si indica immediatamente i volumi di sospensione e di solvente da usare e può essere generalizzata come 1 : (FD-1). • La terza nomenclatura permette di indicare sinteticamente quanto la nuova sospensione è diluita rispetto a quella di partenza. Le diluizioni possono essere semplici o sequenziali. Nel primo caso si effettua una sola diluizione, nell’altro se ne effettuano diverse in sequenza. La diluizione sequenziale si effettua diluendo un volume di sospensione iniziale in FD-1 volumi di solvente in un primo tubo, si mescola, si riprende un volume da questo tubo e lo si aggiunge a FD-1 volumi nel secondo e così via. Il fattore di diluizione di una diluizione semplice viene indicato sinteticamente come base (b) della diluizione, mentre la lettera D indica il numero di diluizioni. In questo caso, il FD di una diluizione semplice sarà: Formula 1

FD = b1

(ed infatti FD = FD)

In una diluizione sequenziale per D>1, si ha invece Formula 2

FD = bD

Infatti il FD finale è il prodotto del FD semplice per se stesso ripetuto D volte. Dal punto di vista numerico, se diluisco con b=10 tre volte ho che FD =103 = 1000, infatti all’atto delle prima diluizione avevo un FD di 10 volte, all’atto della seconda di 10 x 10 = 100 volte e all’atto della terza di 10 x 10 x 10 =1000 volte. Nelle diluizioni, è possibile che a volte si cambi il fattore di diluizione semplice (b) per comodità, per esempio all’inizio è 100, poi 10 ed infine è 2 per ottenere una maggior precisione. In ciascuno dei tre casi verranno operate una o più diluizioni D. Per esempio, si prelevano 10 g di suolo e lo si stempera in 100 ml di acqua (b=100, D=1), poi si effettua una diluizione sequenziale (o seriale) con b = 10 e D = 4, infine un’altra diluizione seriale con b= 2 e D =3. Il fattore di diluizione finale sarà FD = 1001 x 104 x 23 = 100 x 10.000 x 8 = 8 x 106. In definitiva, avremo diluito il campione iniziale 8 milioni di volte. Questa formulazione va generalizzata nella seguente: Formula 4

𝐹𝐷 = ∏𝑛𝑖=1 𝑏𝑖𝐷𝑖 (che sarebbe come dire b1D1 x b2D2 x b3D3)

B- Le conte vitali Il concetto fondante delle conte vitali è che una cellula dia vita ad una ed una sola colonia in una piastra di terreno solidificabile. In questo caso, contando il numero delle colonie conosceremo anche il numero delle cellule da cui sono state originate. Infine, mediante la conoscenza delle diluizioni effettuate, sarà possibile risalire alla densità delle cellule presenti nella sospensione da analizzare. La Densità cellulare (DC) è la grandezza in uso nelle conte microbiche e si misura come cellule/mL o come cellule/g a seconda che si parta da un substrato liquido o solido. La pratica delle conte vitali consiste nell’effettuare una diluizione seriale per poi spandere in piastra un’aliquota di sospensione che permetta di ottenere un numero colonie per piastra variabile fra 30 e 300. Tale valore viene applicato per piastre Petri standard con diametro di 90 mm, equivalenti a ca 64 cm2, il che significa che in genere sarà possibile disporre un massimo di ca 5 colonie per cm2. Esistono due sistemi fondamentali di analisi delle conte vitali, uno per spandimento, l’altro per disseminazione o inclusione. Nella conta per spandimento, si trasferisce 0.1 mL di sospensione per ciascuna piastra della conta. Tale volume è stato determinato empiricamente perché permette di distribuire tutto il volume sulla piastra standard, senza lasciare zone non occupate dalla sospensione (come avverrebbe per volumi inferiori) e senza lasciare liquido non assorbito sulla piastra, come nel caso di volumi molto maggiori. Va notato che in questa tecnica, la superficie di ogni piastra riceverà le cellule di 0.1 mL della diluizione corrispondente. Nella conta per disseminazione esistono due varianti: a. Variante tradizionale In questo caso si effettua la diluizione seriale non in tubi con acqua, ma con il terreno di coltura solidificabile a 40°C nel caso dell’agar e a ca 24°C nel caso della gelatina. In pratica, si preleva 1 mL dalla sospensione originale e lo si mescola con 9 mL di terreno fuso del primo tubo. Si cambia pipetta e si preleva 1 mL del primo tubo e lo si trasferisce nei 9 mL del secondo e così via fino all’ultimo tubo. In questo modo, in ogni tubo viene a trovarsi una quantità di cellule contenute in 1 mL. Ogni tubo viene poi versato in una piastra Petri vuota in cui il terreno si distribuirà con le cellule ben separate all’interno di tutto il volume. Sostanzialmente, alla fine della procedura, in ogni piastra si hanno le cellule presenti in 1 mL della diluizione corrispondente. Questa variante è costosa e complessa per via dell’uso dell’agar nei tubi ed è spesso sostituita dalla seguente variante più in uso. b. Variante moderna In questa tecnica le diluizioni vengono effettuate in acqua come per lo spandimento. Da ogni tubo si trasferisce, con una pipetta, 1mL di sospensione in una piastra vuota, che poi viene aggiunta di ca 12 mL di terreno fuso. Come nell’altra variante, le piastre riceveranno le cellule contenute in 1mL della diluizione corrispondente, ma si evita l’uso dei tubi con l’agar fuso. Per entrambi i metodi (spandimento e disseminazione) va ricordato, infine, che non è strettamente necessario piastrare da tutte le diluizioni. La pratica comune è piastrare dalla diluizione ritenuta più probabile, da una inferiore e da una superiore.

Calcolo della Densità in conta totale. In tutti i casi, la formula per calcolare la DC sarà: Formula 5

DC = Mp x FD

Dove M è la media di due o più conte di colonie in piastre derivanti da tubi con la stessa diluizione. Nella buona pratica di laboratorio si applicano normalmente tre repliche. Nel caso dello spandimento la densità sarà: Formula 6

DC = Mp x FD x 1/0.1 ➔ DC = Mp x FD x 10

Il fattore 1/0.1 è dovuto al fatto che non si piastra un intero mL, ma solo un decimo, per cui il piastramento di fatto rappresenta una diluizione di FD = 10. Nel caso in cui la conta per spandimento avvenga con diluizioni con b=10, la formula 6 può essere ulteriormente semplificata come: Formula 7

DC = Mp x 10(D+1)

Infatti con b=10, FD = 10(D) che dovrà poi essere moltiplicato per 10 per via del piastramento di 0.1 mL, per cui si avrebbe FD = 10(D) x ➔ FD = 10(D+1) Per la conta per disseminazione, invece, oltre alla formula 5 si può applicare, nel caso di b=10 la formula semplificata:

Formula 8

DC = Mp x 10(D)

C- Le conte totali Le conte totali si dividono in: a. Dirette b. Indirette Nelle conte totali dirette si calcola direttamente il numero delle cellule in appositi strumenti chiamati camere contaglobuli. Invece, le conte totali indirette si basano sulla stima della densità cellulare a partire da parametri fisici (torbidità) o chimici (contenuto di N, C, DNA etc) che aumentano all’aumentare della densità cellulare. C.a. Conte totali dirette con vetrino di Thoma Zeiss Questa camera contaglobuli consta di un vetrino spesso con al centro una zona di profondità 100 µm suddivisa in quadratini elementari di 50 µm di lato. Ne consegue che ogni parallelepipedo con base il quadratino elementare avrà un volume pari a 100 x 50 x 50 = 250,000 µm3. Un mL è pari a 1000 mm3; a sua volta un mm3 contiene 109 mm3, per cui 1 mL = 1012 µm. Ne consegue che il volume del parallelepipedo che insiste sul quadratino elementare sarà quindi 1012/250 103 = 4 * 106. Questo dato corrisponde di fatto al FD tipico del vetrino Thoma Zeiss. Per cui le cellule contenute in 1 mL saranno pari alla media delle cellule contenute nel parallelepipedo elementare moltiplicato per 4 * 106. In un vetrino

Ne consegue che la densità cellulare con il Thoma Zeiss sarà calcolata con la seguente Formula 9 Formula 9

DC = 4 * 106 *FD* Mc

dove Mc è la media delle cellule contate in almeno 100 quadratini elementari, FD è il fattore di diluizione eventualmente applicato alla sospensione prima della lettura nel vetrino Thoma Zeiss.

C.b. Conte totali indirette Le conte totali indirette vengono effettuate misurando una qualche variabile fisica o chimica della sospensione che sia relazionabile in maniera lineare al numero delle cellule totali. Per esempio si può usare il peso secco in gravitometria, la torbidità con la turbidometria o la nefelometria, lette mediante spettrofotometro o nefelometro, rispettivamente, la quantità di azoto, la quantità di DNA e così via. In tutti i casi la procedura prevede tre passaggi 1. Allestire una serie di diluizioni e valutare il numero delle cellule mediante conta totale diretta, questo determina il valore Dtd, ovvero densità in conta totale diretta. 2. Misurare ciascuna sospensione per il parametro scelto (peso secco, torbidità, DNA etc…) ottenendo così la densità in conta totale indiretta Dti 3. Valutare la curva standard confrontando i valori di Dtd coni Dti per cui alla fine si possa stabilire la funzione della Formula 10 Formula 10

Dtd = a + b*Dti

In cui “a” è il valore dell’intercetta della curva di regressione e “b” il suo coefficiente angolare. La curva ideale ha un basso valore di “a”, al limite uguale a 0 e un R2 prossimo ad 1.00.

D. Conte in peso Nel caso il substrato da analizzare non sia un fluido, e in particolare un liquido, la conta andrà espressa non come cellule per mL ma per g di substrato. In queste conte, con qualsiasi metodo vengano poi condotte, è necessario che sia noto il peso iniziale e il volume di liquido (acqua, sol. Fisiologica etc.) in cui esso è stato risospeso prima della conta vera e propria. Un caso tipico prevede il prelievo del suolo con una spatola sterile o da un carotatore, la sua pesata (es 5.2 g), tale porzione di campione viene risospesa in un volume di acqua (ad es 25 mL) e omogeneizzata con un metodo appropriato. Dalla sospensione si procede come descritto nei paragrafi precedenti fino ad ottenere la Dc espressa in cellule mL-1. A questo punto la Dcp ( densità cellulare in peso) si ottiene con la formula 11 Formula 11

Dcp = Dc * (V/P) [ c g-1]

Va ricordato che il rapporto V/P può essere anche descritto come Correzione per il Peso , ovvero Cp = V/P [mL g-1] Per cui la conversione della densità può essere effettuata con la formula 11 bis Formula 11 bis

Dcp = Dc * Cp [ c g-1]

Selezione in Microbiologia Come calcolare il numero di piastre necessarie per un dato tipo di selezione, avendo una frequenza f di mutazione. La maggior differenza fra i vari tipi di selezione sta nel numero di cellule che vengono piastrate in ogni piastra. Tale parametro CP è basso (100-300) nelle selezioni che agiscono a livello di colonia e che quindi possono permettere solo il piastramento di un numero di cellule vive pari al massimo accomodabile in una piastra da 90 mm di diametro (circa 200). Le selezioni con basso CP sono quella a vista e quella indiretta. Le selezioni diretta ed indiretta inversa, invece, agiscono a livello di cellula per cui si possono piastrare da 107 a 108 cellule per piastra, di cui solo poche daranno vita alle colonie che rappresentano il risultato stesso della selezione.

La formula generale per calcolare il numero P delle piastre è: 𝑃=

1 𝑓 ∗ 𝐶𝑃

Vediamo alcuni esempi: A. selezione a vista, f = 10-5 𝑃=

1 10−5 ∗ 102 1 10−3

𝑃=

𝑃 = 103 B. Selezione diretta, f = 10-5 𝑃=

1 ∗ 107

10−5

1 102

𝑃=

1 100 Ovvero basta molto meno di una piastra o, se si preferisce, in una piastra posso attendermi 100 mutanti. 𝑃=

L’Efficienza può essere definita come 𝐸=

1 𝑃

Per cui nella selezione a vista dell’esempio sarà 10-3, in quella diretta 102 UNA PRIMA GENERALIZZAZIONE La formula precedente può essere ulteriormente generalizzata con la seguente: 𝑃=

𝑘 𝑓 ∗ 𝐶𝑃

In cui k è un fattore dipendente dal disegno sperimentale. In particolare k =3 nel caso di una selezione indiretta per un solo auxotrofo in quanto avrò bisogno di una piastra madre (master plate) iniziale e poi di una piastra in terreno permissivo ed una in terreno selettivo per un totale di tre piastre per ogni piastra analizzabile. Nel caso in cui si vogliano isolare auxotrofi diversi in un solo esperimento, avremo bisogno di una piastra madre, di una piastra in condizioni permissiva e di n piastre in condizioni selettive. Per questo esperimento, quindi avremo che k =2+n Più in generale, k dipende da tutte le variabili di disegno sperimentale. UN’ULTERIORE GENERALIZZAZIONE Nel caso in cui si voglia selezionare una popolazione microbica non clonale, e quindi dotata di una sua variabilità intrinseca, non tutte le mutazioni produrranno un fenotipo diverso da quello parentale e quindi selezionabile in maniera differenziale. Per capire meglio il concetto, atteniamoci al caso della mutazione che comporti perdita di funzione e trasformi un allele da dominante a recessivo ed osserviamo la seguente tabella in cui sono riportati tutti i genotipi e fenotipi possibili per un solo locus biallelico in dominanza. Notare che la mutazione colpisce un solo allele per locus. Per evidenziare questo aspetto, l’allele soggetto a mutazione per loss of function (perdita di funzione) è contrassegnato con l’asterisco (*). Genotipo parentale AA AA Aa Aa aa aa

Genotipo mutato A*A AA* A*a Aa* A*a aa *

Fenotipo parentale A+ A+ A+ A+ AA-

Fenotipo mutato A+ A+ AA+ AA-

Dalla tabella, appare evidente, che solo la condizione della terza riga presenta una variazione selezionabile fra il fenotipo mutato e quello parentale. Tale condizione corrisponde al caso in cui l’allele dominante di un eterozigote diventi recessivo. Da questa osservazione, possiamo generalizzare dicendo che solo la metà degli eterozigoti di una popolazione diploide può essere selezionata. Questo non significa che gli altri genotipi non subiscano mutazioni, ma solo che i mutanti che da essi derivano non sono distinguibili dai parentali e quindi selezionabili. Queste considerazioni ci portano a generalizzare ulteriormente la formula sviluppata sin qui, considerando che la popolazione da selezionare abbia una sua omozigosità (Ho) ed una sua eterozigosità (He) e che il totale della popolazione è dato dalla somma di queste due parti. Eq. Per diploidi 𝑃=

𝑘 2 ∗ (𝐻𝑜 + 𝐻𝑒) ∗ 𝑓 ∗ 𝐶𝑃 𝐻𝑒

Nel caso di popolazioni aploidi non si pone il problema della eterozigosità, ma della frequenza di individui con alleli recessivi che non siano quindi selezionabili nel caso di mutazioni per loss of function. L’ equazione precedente va quindi trasformata nella successiva in cui D ed R indicano rispettivamente i dominanti ed i recessivi della popolazione aploide parentale

Eq. Per aploidi 𝑃=

𝑘 𝐷+𝑅 ∗ 𝑓 ∗ 𝐶𝑃 𝐷

Da questo gruppo di equazioni risulta quindi chiaro che la selezione ha un efficienza inversamente proporzionale al numero delle piastre da impiegare e che questo dipende da una serie di fattori che riassumiamo brevemente in maniera sinottica nella tabella conclusiva di seguito. Fattore k

f CP

Ho He D R P E

Significato Fattore che dipende dal disegno sperimentale, in particolare: k= 1 per selezione a vista, diretta e indiretta inversa k= 3 per selezione indiretta per un solo auxotrofo k= 2 + n nel caso di selezione indiretta per n auxotrofi Frequenza di mutazione. Oscilla da circa 10-3 per elevatissimi livelli di mutazione a circa 10-6 – 10-7 per i livelli naturali di mutazione spontanea Questo fattore indica il numero di cellule piastrabili. In generale, per la selezione a vista ed indiretta questo valore oscilla da 100 a 300 in quanto tutte le cellule cresceranno e daranno colonie, la selezione poi agisce su un fattore visivo che non limita la crescita dei mutanti o dei parentali. Viceversa, per la selezione diretta o indiretta inversa, tale valore può spingersi fino a 107 o 108 in quanto la stragrande maggioranza delle cellule non produrrà colonie essendo impedita dalle condizioni selettive che non permettono la crescita (o uccidono) le cellule da NON selezionare. Quota di omozigoti di una popolazione non clonale diploide Quota di eterozigoti di una popolazione non clonale diploide Quota di dominanti di una popolazione non clonale aploide Quota di recessivi di una popolazione non clonale aploide Numero di piastre stimate come necessarie per un esperimento di selezione Efficienza del sistema

Trattazione della Fase esponenziale della curva di crescita microbica Introduzione La curva di crescita di una cultura microbica è contraddistinta da quattro fasi se considerata conta vitale da cinque fasi se considerata in conta totale. Le quattro fasi comuni ad entrambe le conte sono nell’ordine: fase di latenza, fase esponenziale, fase stazionaria e fase di morte. In conta totale, dopo la fase di morte, è possibile verificare anche la cosiddetta fase di lìsi in cui le cellule, già morte, si disgregano per cui finiscono per non essere più neppure contabili in conta totale. La fase esponenziale, per la sua regolarità, permette una trattazione matematica delle diverse variabili che entrano in gioco. Dal momento che la maggior parte della biomassa microbica viene prodotto effettivamente durante la fase esponenziale, questa trattazione permetterà anche di valutare tutti i parametri necessari a progettare una fermentazione in maniera quantitativa. La ragione per cui è importante progettare una fermentazione sta nella miglior utilizzazione possibile dei substrati, delle cellule, degli impianti e del tempo necessario per condurre la fermentazione stessa. Inoltre, uno dei parametri fondamentali, ovvero il tempo di generazione g, è anche uno degli indici fondamentali per dedurre quantitativamente lo status di salute delle cellule. I parametri della fase esponenziale I parametri fondamentali per studiare la fase esponenziale sono: a. Il tempo entro cui si effettua l’analisi ∆𝑡; b. Il tempo di generazione g c. La densità seriale o di inoculo Di d. La densità finale Df e. Il numero delle generazioni n L’assunto fondamentale per questa trattazione è che ad ogni generazione numero di cellule duplica. Questo aspetto è chiaramente diverso dal concetto di generazione che possiamo avere considerando animali e piante, ma descrive perfettamente l’andamento l’aumento di biomassa di una popolazione microbica durante la fase esponenziale. Questo primo assunto viene sintetizzato nella Formula 1. Formula 1

𝐷𝑓 = 2𝑛

Di fatto, la Formula 1 descrive l’aumento della popolazione a partire da una sola cellula di inoculo. Se invece le cellule sono, come avviene nella realtà, un numero diverso da uno misurabile come densità iniziale, allora la Formula 1 viene generalizzata nella Formula 2 Formula 2

𝐷𝑓 = 𝐷𝑖 ∗ 2𝑛

A questo punto dobbiamo introdurre un altro assunto fondamentale, ovvero che le generazioni abbiano tutti la stessa durata nell’ambito della fase esponenziale. Questo assunto è strettamente limitato alla fase esponenziale, in quanto i tempi diventano lunghissimi nella fase stazionaria iniziale...