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BOTBLOT OBJETIVOS. Detectar la presencia de anticuerpos específicos en ratones inmunizados. Aprender los fundamentos de la técnica de Dot Blot INTRODUCCIÓN Dot Blot es una técnica de biología molecular para detectar biomoléculas. Representa una simplificación de los métodos Northern blot, Souther blot o Western blot. En un dot blot las biomoléculas para ser detectados no son separadas por cromatografía. En cambio, una gota que contiene la molécula para ser detectada se aplica directamente sobre una membrana. Esto es seguido por la detección por sondas de nucleótidos (northern blot y southern blot) o anticuerpos (para un western blot). La técnica ofrece importantes ahorros en tiempo. Sin embargo, no ofrece información sobre el tamaño de la biomolécula blanco. Además, si dos moléculas de diferentes tamaños son detectadas, se seguirá viendo como un solo punto. Por lo tanto, el dot blot sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. La siguiente imagen ilustra el resultado obtenido de realizar un protocolo dot blot en el que se fijaron muestras de ADN a la membrana, y posteriormente se hibridaron con sondas marcadas radiactivamente específicas de ciertas regiones del ADN de estudio. Solamente las muestras portadoras de la región de interés se revelaron (puntos oscuros). Cuanto mayor es la cantidad del ADN de interés, mayor es la intensidad del color negro.

Fig. 1 Resultado de un Dot blot de ADN

Tipos de dot blot ASO Dot blot

Esta técnica, cuyas siglas ASO vienen del inglés Allele Specific Oligonucleotides, constituye una de las metodologías que aplican la estrategia dot blot, es decir, la deposición de muestras con las moléculas de interés sobre una membrana para, posteriormente, revelar los resultados de presencia o ausencia de los elementos de estudio mediante marcaje con sondas dirigidas contra dichos elementos.

Este método consiste en amplificar el ADN de interés (por PCR por ejemplo) y fijarlo directamente a la membrana de trabajo (por ejemplo con irradiación UV), para luego añadir oligonucleótidos de unas 20 pb específicos del alelo que quiere detectarse. Estos oligos son marcados previamente con radiactividad, fluoróforos o cualquier otro tipo de marcaje. Tras la hibridación, se obtienen los resultados detectando el marcaje utilizado. Una aplicación directa de este protocolo es la detección de mutaciones, de manera que se fija una fila de muestras, cada una correspondiente a un individuo diferente, del cual se ha amplificado la región de ADN que puede o no contener la mutación. Primeramente se hibridan las muestras con un oligo específico de uno de los alelos (el silvestre o normal, por ejemplo) y se revela el resultado. A continuación, se lava la sonda y se añade una nueva, específica del otro alelo (el alelo mutado, por ejemplo). Aquellos individuos que dieran positivo para las dos hibridaciones serían heterocigotos para la mutación (poseen un alelo normal y el otro mutado), mientras que aquellos que solamente presentasen hibridación en uno de los casos serían homocigotos para ese caso (para el alelo silvestre o el mutado).

En la siguiente imagen se ilustra un ejemplo de resultado obtenido de este procedimiento:

ASO dot blot inverso Se basa en el mismo procedimiento metodológico que en el ASO dot blot, con la salvedad de que son los alelos las moléculas fijadas a la membrana, mientras que el ADN del paciente o individuo a estudio es el que hace las veces de sonda. Normalmente se establecen dos filas de muestras, cada una con distintas variantes alélicas normales o mutantes (cada columna equivale a un alelo en su versión normal o mutada). Y sobre dichas muestras se aplica el ADN marcado del individuo a estudio. Así, se averigua qué alelos presenta en homocigosis o en heterocigosis y si ello determinará el desarrollo de cierta enfermedad. La siguiente imagen muestra un posible ejemplo de aplicación de la técnica:

MATERIAL CANTIDAD 1

MATERIAL Una membrana de nitrocelulosa de 5 cm de alto por 3 cm de ancho.

1

Micropipeta de 2ul con puntas.

1

Micropipeta de 20 ul con puntas.

5

pipetas de 5 ml.

3

tubos de ensaye de 5 ml.

1

Navaja de bisturí.

2 1 1

Guantes Lápiz Regla

REACTIVO anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa. Solución de revelado: 5 ml de PBS; 8 mg de DAB; 15 ul de H2O2 al 30%. PREPARAR AL MOMENTO DE REVELAR. Proteína usada para inmunizar ratones (práctica 1). Solución de leche al 3% en PBS-Tween. Suero de los ratones de la práctica de inmunización (diluido 1:100 en PBS-Tween) PBS Tween.

PROCEDIMIENTO REPORTE DE LA PRACTICA.

En el reporte de la práctica tendrá que incluir una discusión de qué significan los resultados que obtuvo y, en la conclusión, determinar si la inmunización de los ratones generó la producción de anticuerpos específicos. Estos resultados también le permitirán realizar la discusión y conclusión de la práctica 1.

CUESTIONARIO.

1.

¿Cuál es la finalidad de realizar un Dot- blot?

2.

Confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. ¿Cuáles son los pasos principales para realizar un Dot-blot?

Todo procedimiento de blotting consta de 5 etapas: • Inmovilización de proteínas sobre la membrana ya sea mediante transferencia (electroforética, aspiración, presión, etc.) o mediante aplicación directa. • Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas. • Incubación del blot con anticuerpo primarios contra la/s proteína/s de interés. • Incubación del blot con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores. • Las bandas de proteínas marcadas con enzimas se hacen visibles por incubación con los sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las bandas de proteína. Hay tres métodos para transferir proteínas a las membranas: • Transferencia capilar • Transferencia por difusión • Transferencia electroforética ('electroblotting') 3.

¿Qué diferencias existen entre Dot-blot, Western-Blot y ELISA? El Western Blot es una técnica analítica usada para detectar una proteína especifica en un extracto crudo, mediante el uso de anticuerpos. Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmune de un animal (inmunoglobulinas) que son capaces de detectar proteínas ajenas (antígenos) y unirse específicamente a ellas. El ELISA es un ensayo que permite la cuantificación de una proteína en una mezcla mediante el uso de un anticuerpo y un antígeno. Si bien el fundamento es la especificidad de la unión anticuerpo-antígeno al igual que el Western Blot, el procedimientos s mucho más sencillo y rápido, aunque de menor sensibilidad con respecto a este último.

4.

¿Qué reactivos biológicos utilizará en la práctica?

5.

¿Para qué se requiere la Diaminobencidina (DAB). Se usa como sustrato de la enzima ligada al anticuerpo secundario

BIBLIOGRAFÍA.

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm...