Southern Blot e Northen Blot PDF

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Summary

Breve riassunto esplicativo dei singoli passaggi delle tecniche di biologia molecolare di Southern e Northen Blot...

Description

Southern Blot Tecnica di biologia molecolare volta all'individuazione di DNA all'interno di una soluzione complessa (1975, Edwin Mellon Southern). 

Estrazione e purificazione del DNA dal campione

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desossiribonucleasi II (sitoTrattamento con enzimi di restrizione: specifiche), idrolasi che spezzano i legami fosfodiesterici del DNA, effettuando tagli endonucleotidici sito-specifici

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Elettroforesi su gel di agarosio: i frammenti di acido nucleico subiscono così una separazione, in cui diverse lunghezze creano una mappa (utilizzata in diagnostica per analizzare eventuali mutazioni su geni specifici RFLP: Restriction Fragment Length Polymorpshisms)

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Denaturazione: i frammenti di DNA vengono immersi in una soluzione alcalina (NaOH 0,5M o NaCl 1M) dove vanno incontro a denaturazione

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Trasferimento su membrana (bloatting): “il gel viene coperto da un foglio di nitrocellulosa o nylon (…) con sopra pila di fogli assorbenti. Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, la membrana e a legarvisi” (fonte: https://it.wikipedia.org/wiki/Southern_blot)

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Ibridazione con sonda marcata: il foglio viene poi messo in una soluzione contente una sonda (marcata radioattivamente o con fluorescenza), con la quale il DNA bersaglio subisce una reazione di ibridazione

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Lavaggio della membrana per eliminare residui di sonda non ibridate

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Esposizione su lastra autoradiografica per l’evidenziare la sequenza d’interesse

Northern Blot Tecnica laboratoriale di biologia molecolare volta all'individuazione di RNA 

Estrazione e purificazione del RNA dal campione, con particolare attenzione a tutte le procedure e le precauzione utili alla manipolazione del RNA

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Separazione dei frammenti tramite elettroforesi su gel denaturante

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Trasferimento su membrana di nylon (bloatting): come nel Southern Blot, grazie al fenomeno della capillarità la soluzione contente RNA si trasferirà dal gel al nylon, a cui vi si legherà tramite legami deboli. Il complesso membrana/RNA è sottoposto ai raggi ultravioletti, quali promuovono la formazione di legame covalenti tra le parti

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Ibridazione con sonda marcata: il foglio viene poi messo in una soluzione contente una sonda marcata con la quale il RNA bersaglio subisce una reazione di ibridazione

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Lavaggio della membrana per eliminare residui di sonda non ibridate

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Visualizzazione del segnale tramite autoradiografia o colorimetria

 Pro e contro: 1) Quantitativa ma poco sensibile 2) Procedura lunga e limitata alla capacità di legame della membrana...