Western Blot – Preguntas PDF

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Pregunta exposicion...

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El Western Blot (WB), también conocido como “protein blotting” o “inmunoblotting”, es una técnica que sirve para la inmunodetección y cuantificación de proteínas específicas. Esta técnica permite transferir las proteínas de un gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS) a una membrana absorbente, siendo las proteínas transferidas a la membrana una copia exacta del gel donde han sido separadas por electroforesis. Esta transferencia de gel a membrana supone una gran herramienta para la detección y caracterización de proteínas, especialmente las que están en bajas abundancias PASOS 1. Preparacion de muestra Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas 2. Electroforesis El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el tampón de migración. Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre 20 y 40 µg por calle. Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas hacia el polo positivo El resultado es que las proteínas se separan en función de su talla, o peso molecular 3. Transferencia gel membrana Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia). 4. Bloqueo[editar] Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse a las proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino , leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos. 5. Detección En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.

UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE Biología Molecular Western Blot – Preguntas

Integrantes: Andrade Nicolás, Grijalva Daniela, Gudiño Anthony, Ordoñez Cintia, Paca Paola, Ramos Darla, Pilicita Yesseña NRC: 5252 -

¿Cuáles son las siglas del gel de poliacrilamida usada en la electroforesis? 1. 2. 3. 4.

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SDS PVDF PLD PAGE

¿Qué cantidad de máxima de lisados proteicos se cargan en las calles del gel? 1. 2. 3. 4.

20 µg 40 µg 30 µg 25 µg...