Practica N° 3 - Análisis DE Proteínas – Western BLOT PDF

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PRACTICA 3ANÁLISIS DE PROTEÍNAS – WESTERN BLOTINTRODUCCIÓNFigura 1. Identificación de proteínas especificas por la técnica del western blot. El Western blot (WB) tiene diversas aplicaciones para investigar eventos moleculares reguladores que sustentan el metabolismo energético, el recambio de proteí...

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PRACTICA 3 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS – WESTERN BLOT

INTRODUCCIÓN

Figura 1. Identificación de proteínas especificas por la técnica del western blot.

El Western blot (WB) tiene diversas aplicaciones para investigar eventos moleculares reguladores que sustentan el metabolismo energético, el recambio de proteínas y las adaptaciones fisiológicas crónicas. Por ejemplo, el WB se puede utilizar para investigar la abundancia de proteínas, la actividad quinasa, la localización celular, las interacciones proteína-proteína o el seguimiento de modificaciones postraduccionales. El principio de la WB se basa en unos pocos pasos amplios (figura 1):

i) Extracción de proteínas celulares de una mezcla compleja de proteínas intracelulares y extracelulares (de tejido, células, etc.). ii) Cuantificación de la concentración de proteínas y separación electroforética de proteínas dentro de una matriz de gel. iii) Transferencia a una membrana con alta afinidad por proteínas. iv) "Bloqueo" de la membrana para reducir la unión no específica. v) Detección de antígeno por anticuerpos específicos para la proteína o proteínas de interés. vi) Incubación con un anticuerpo secundario ligado a un marcador (por ejemplo, quimioluminiscente o fluorescente). vii) Desarrollo y detección de la señal, que es teóricamente proporcional al grado de unión de antígeno / anticuerpo. viii) Cuantificación de las bandas resultantes utilizando software de densitometría. Western blot es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido (figura 2). El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o químico. Un Western Blot se utiliza a veces para diagnosticar enfermedades.

Figura 2. Electroforesis de proteína total y detección de proteínas por western blot.

OBJETIVO • •

Cuantificar por el método absoluto los niveles de expresión de la proteína GST procesadas por la técnica Western Blot. Analizar e interpretar los niveles de expresión génica de los genes GST obtenidas por la técnica Western Blot

MATERIALES Y MÉTODOS Materiales • • • •

Geles de electroforesis de proteínas Fotografías de Western blot obtenidas de membranas de PVDF. Software: Imagen J (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) Paquete de office

Métodos. •

Observa el vídeo sobre el proceso del western blot y realizar un resumen protocolizado. https://www.youtube.com/watch?v=HocmMZUieFg Del video observado se puede dar un protocolo estandarizado: 1. 2. 3. 4.

Realizar una electroforesis de la muestra con las proteínas Transferir las proteínas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa. Coloración de las proteínas para confirmar transferencia. Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos remanentes en la membrana de nitrocelulosa. 5. Seguidamente una incubación con el anticuerpo específico primario 6. Lavados del anticuerpo no unido. 7. Detección del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a peroxidasa (HRP). 8. Revelado con sustrato quimio luminiscente y detección con placas radiográficas •

ESTADIOS 60 50 40 30 20 10 5

A partir de una fotografía de western blot, realice una curva de calibración de intensidad (densidad) versus concentración de la proteína B-actina. Obtenga la ecuación de la recta.

D. SIN RUIDO 153790 152147 132049 125328 67106 33684 20518

Con las imágenes de western blot, para el gene GST F determine las concentraciones absolutas y explique el porqué de los cambios en los niveles de expresión a través del desarrollo y germinación del grano de polen.

DESARROLLO DE POLEN:

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Estadio de célula madre (cm). Estadio de meiosis I (diadas). Estadio de meiosis II (Tétradas). Microspora Polen juvenil

GERMINACIÓN DEL GRANO DE POLEN:

Identifique un paper de los últimos 5 años de la base Scopus o web of science que contenga trabajos con western blot durante el desarrollo de algún organismo vivo, prepare una presentación power point y exponga en la siguiente clase.

CUESTIONARIO 1. ¿Qué diferencia existe entre anticuerpos monoclonales y policlonales?

✓ Los anticuerpos policlonales son una mezcla heterogénea de anticuerpos que generalmente son producidos por diferentes clones de células B en el cuerpo y los anticuerpos monoclonales son generados por células B idénticas que son clones de una célula madre ✓ Los anticuerpos monoclonales tienen afinidad monovalente y solo reconocen el mismo epítopo de un antígeno. Los anticuerpos policlonales (pAbs) son una mezcla heterogénea de anticuerpos que generalmente son producidos por diferentes clones de células B en el cuerpo 2. ¿Cuál es el procedimiento para purificar anticuerpos para un western blot?

Para purificar anticuerpos se debe tomar en cuenta los siguientes pasos: ✓ Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmente mediante electro transferencia. Se construye lo que se conoce como sándwich, donde se apilan sucesivamente una esponja plana, papel absorbente, el gel, la membrana sintética, más papel y finalmente otra esponja. ✓ Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos. “bloqueo de membrana para prevenir la unión específica de los anticuerpos a otras proteínas. ✓ Incubación con anticuerpos específicos y revelado. ✓ Incubación del blot con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas u otros marcadores. ✓ Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que reconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario). ✓ Sistema de revelado de las bandas de proteínas marcadas con el complejo de anticuerpos. 3. ¿Qué tipos de anticuerpos se utilizan para realizar una detección por western blot?

✓ Los anticuerpos que se utilizan para la detección son los de tipo policlonales ya que son más sensibles que los monoclonales, lo que resulta especialmente relevante si se pretende detectar proteínas poco abundantes en la muestra. Anticuerpos policlonales anti-IDS. 4. ¿Qué diferencia existe entre un anticuerpo primario y secundario, utilizado en la técnica de western blot?

✓ Un anticuerpo que puede atar a una proteína específica o a una biomolécula del interés se llama un anticuerpo primario. Los anticuerpos primarios se producen como anticuerpos monoclonales (los mAbs) o policlonales (pAbs) usando la especie animal tal como la rata, el ratón, la cabra, y el conejo como ordenadores principales mientras que, un anticuerpo

secundario ata con un anticuerpo primario que se sujete directamente al antígeno del objetivo. Después de que la región de V de un anticuerpo primario ate al antígeno, un anticuerpo secundario etiqueta sujeta su región de V al vástago o a la región de C del anticuerpo primario. 5. ¿Cuál es la estructura de los anticuerpos, que zonas son las que se unen a las proteínas específicas?

✓ La estructura que presentan todos los anticuerpos es muy similar, ya que todos presentan en su composición una proteína cuya forma característica es la “Y”. Por esta razón, los anticuerpos mostrarán esta forma. ✓ Además, presentan unas variaciones en los extremos de dicha proteína que es lo que aporta la diferencia a los anticuerpos. Esta parte de la proteína recibe el nombre de región hipervariable y, gracias a ella, cada variedad de anticuerpo se une a un antígeno diferente. En el momento en que un anticuerpo se encuentra con un antígeno que le es complementario, lo reconoce y lo marca para que otros miembros del sistema inmunitario lo ataquen.

6. ¿Cómo se sintetizan anticuerpos específicos para detectar una proteína?

✓ El Immunohistochemistry tiene un ciclón a la producción mediana, se puede utilizar para las células y los tejidos fijos, puede producir la localización celular, tiene una alta resolución espacial, se centra típicamente en una única proteína, puede las proteínas múltiples de la imagen inmediatamente, y es cualitativo y semicuantitativo. ✓ La otra técnica que estudia la localización es immunocytochemistry. Esta técnica tiene un ciclón a la alta producción, se puede utilizar para las células y los tejidos fijos, puede producir la localización subcelular, puede las proteínas múltiples de la imagen inmediatamente, y es cualitativa y semicuantitativa. Sin embargo, su resolución espacial es limitada por la estructura del tejido. 7. ¿En qué otras técnicas se pueden usar anticuerpos para realizar diagnósticos de enfermedades? Entre las técnicas más utilizadas se encuentran:

✓ La inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ensayo inmunoenzimático (ELISA), el ensayo múltiple y la electroinmunotransferencia (EIT). En estas técnicas se presenta diferencias, pero conservan el fundamento general que es el reconocimiento de la unión antígeno-anticuerpo, por lo que presentamos las características más importantes de dichas pruebas. ✓ La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las técnicas más utilizadas en los estudios de autoinmunidad debido a su fácil manejo y estandarización. Sin embargo, la lectura e interpretación requieren de amplia experiencia. La técnica se basa en el reconocimiento de los anticuerpos que reconocen estructuras antigénicas celulares nativas. ✓ La interacción se evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana, producido en conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones constantes (Fc) de las inmunoglobulinas IgG, IgA y/o IgM. 8. ¿Explique el fundamento de los test de embarazo, VIH, RPR y SARS CoV2, basados en la imunocromatografia?

✓ Test de embarazo4 La prueba Fecuntest strips es un inmunoensayo cromatográfico rápido para la detección de hCG en orina o suero. La membrana se encuentra recubierta con anticuerpos de captura anti-hCG en la zona de prueba (T) y de cabra antiratón en la zona de control (C). Durante la prueba, la muestra reacciona con las partículas de oro coloidal cubiertas con anticuerpos monoclonales de ratón anti-hCG. La mezcla migra por la membrana por capilaridad. Si el resultado es positivo, se formará una banda coloreada con la partícula compleja en la zona de prueba. La ausencia de una banda coloreada en la zona de prueba indica un resultado negativo. Como un control de procedimiento, siempre aparecerá una banda de color en la zona de control independientemente de la presencia de hCG en la muestra.

BIOLOGIA DEL DESARROLLO

✓ Test VIH WL Check HIV 1+2 es un ensayo inmunocromatográfico "in vitro", de lectura visual, para la detección cualitativa de anticuerpos contra los virus HIV-1 y HIV2 en suero, plasma y sangre entera. La prueba consta de un cassette plástico que contiene: ▪ Una membrana de nitrocelulosa sensibilizada con antígenos recombinantes para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) en la zona de prueba "T". ▪ Un parche impregnado con antígenos recombinantes específicos para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) conjugados a oro coloidal. La muestra y el buffer se agregan en el pocillo de muestra "S" solubilizando y mezclándose con el conjugado de antígenos recombinantes. Seguidamente, esta mezcla migra por capilaridad a través de la membrana de nitrocelulosa. Si la muestra es reactiva, los anticuerpos anti HIV-1 y HIV-2 presentes, formarán un complejo con los antígenos conjugados a oro coloidal. Este complejo se unirá posteriormente a los antígenos inmovilizados en la zona de prueba "T" de la membrana de nitrocelulosa, formando así una línea de color rosa-rojo púrpura. La ausencia de dicha línea indica un resultado negativo. Como control de procedimiento, la prueba incluye una zona de control "C" de color celeste que cambia a color rosa-rojo púrpura tras el paso de la muestra. La ausencia de esta línea invalida los resultados.

✓ Test RPR En la prueba rápida para reaginas plasmáticas (RPR), las "reaginas" presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por acción de las mismas con antígeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre partículas de carbón. La reacción produce una aglutinación visible macroscópicamente, favorecida por las partículas de carbón. Las reacciones inespecíficas se evitan con el empleo de antígeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra.

✓ Test Sars Cov-2 El WGene SARS-CoV-2 RT Detection es un ensayo "in vitro" que comprende la retrotranscripción de secuencias específicas del ARN viral, seguida de amplificación por PCR en tiempo real en un paso (one step RT-qPCR). Este ensayo de detección cualitativa de secuencias del genoma viral, se realiza a partir de muestras biológicas de origen respiratorio (hisopados nasofaríngeo u orofaríngeo) de individuos con sospecha de COVID-19. El kit detecta dos de los genes virales que presentan mayor relevancia diagnóstica: RdRp (correspondiente a la ARN polimerasa viral dependiente de ARN) y N (correspondiente a la nucleocápside). El procedimiento completo consiste en la purificación del ARN viral a partir de la muestra biológica, el cual luego se utiliza en la etapa de retrotranscripción seguida de PCR en tiempo real en un paso utilizando sondas tipo TaqMan®. El ARN de SARS-CoV-2 se transcribe a ADNc (ADN copia) mediante la enzima transcriptasa reversa, el cual se utiliza como molde para la amplificación por PCR mediante una enzima Hot Start ADN polimerasa. Durante la reacción de PCR, la actividad exonucleasa de la enzima provoca la degradación de la sonda tipo TaqMan® separándose el fluoróforo del quencher. El aumento de la señal de fluorescencia resultante por acumulación del ADN templado, es detectado por el instrumento de PCR en tiempo real: canal

BIOLOGIA DEL DESARROLLO FAM para detección conjunta de los genes RdRp y N, y canal YAK (Yakima Yellow, o VIC/JOE/HEX) para detección del gen de la ARNasa P como control interno endógeno. Este control endógeno, asegura la presencia de ácidos nucleicos de la muestra clínica y la ausencia de inhibidores en la reacción de amplificación. CONCLUSIONES: ✓

En semillas secas y latentes, los embriones de plantas y el endospermo circundante muestran actividades metabólicas muy limitadas, por lo que se especula que la producción de ROS es muy baja (Bailly et al., 2008).

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La correlación espacio-temporal de una mayor producción y acumulación de ROS durante el inicio de la germinación se ha corroborado con experimentos en los que oxidantes aplicados de forma exógena, como el H 2 O 2 (El-Maarouf-Bouteau et al., 2015), y un agente provocado farmacológicamente o genéticamente. disminución de la catalasa o de otras actividades antioxidantes, se demostró que influyen positivamente en la liberación de la latencia y el inicio de la germinación (Fig.3) (Leymarie et al., 2012; CembrowskaLech et al., 2015; Basbouss-Serhal et al.., 2017). Recíprocamente, la sobreexpresión de CAT en cebada (Hordeum vulgare) se demostró que las semillas suprimen la germinación precoz ( Ishibashi et al., 2017 ). Por lo tanto, el aumento de los niveles de ROS es clave para una germinación competente y son señales positivas para la liberación de la latencia (Bailly et al., 2008; Singh et al., 2016). En nuestro estudio, las semillas latentes mostraron la mayor actividad de la GST en comparación con las etapas de germinación y esto puede ser debido a los cambios en el metabolismo bioquímico de las semillas durante la germinación, que podría producir algunos metabolitos vegetales secundarios como antocianinas y flavonoides o liberar agliconas de glucósidos conjugados de las cubiertas de las semillas y los cotiledones debido a la activación enzimática [38]. Estos metabolitos pueden inhibir la actividad de la GST durante las etapas de germinación. Por otro lado, GR, CAT, SOD y GPx aumentan durante las etapas de germinación en comparación con las semillas latentes.

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BIBLIOGRAFIA: ✓ ✓

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Bailey ML, et al. (2008) El motivo de histidina dual en el sitio activo de Pin1 tiene un papel estructural en lugar de catalítico. Bioquímica 47(44):11481-9 Una expansión de microbios intestinales de linaje raro caracteriza la artritis reumatoide. Chen J, Wright K, Davis JM, Jeraldo P, Marietta EV, Murray J, Nelson H, Matteson EL, Taneja V.Genome Med. 2016 Abr 21;8(1):43. doi: 10.1186/s13073-016-0299-7. M.L. García-García, C. Calvo Reya, F. Pozo Sánchez, M.C. Vázquez Álvarez, A. González Vergaz, P. Pérez-Breña, I. Casas Flecha.Infecciones por bocavirus humano en niños españoles: características clínicas y epidemiológicas de un virus respiratorio emergente.An Pediatr (Barc), 67 (2007), pp. 212-219 H. Tsutsumi, K. Ouchi, M. Ohsaki, T. Yamanaka, Y. Kuniya, Y. Takeuchi, et al. Immunochromatography test for rapid diagnosis of adenovirus tract infections: comparison with virus isolation in tissue culture. J Clin Microbiol, 37 (1999), pp. 2007-2009...