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TEMA 6- Southern blot analysis I - AISLAMIENTO DEL DNA DE LA PLANTA El southern blot analysis se utiliza para analizar la presencia de un transgen. También se utiliza la PCR para detectar la presencia de un transgen pero no siempre funciona. 1. Purificación del DNA genómico (gDNA): El proceso de extracción de ADN de células vegetales es de gran importancia para el campo de la biotecnología. Es el primer paso en el proceso de análisis. Aunque

existen

diversos

métodos

para

la

purificación de ácidos nucleicos de diferentes organismos, existen 3 pasos comunes: a. Rotura de las células y homogeneización de los tejidos. b. Extracción con Fenol – cloroformo. c. Precipitación alcohólica.

a. Rotura de las células y homogeneización de los tejidos. Se utiliza un proceso mecánico donde las muestras congeladas con nitrógeno líquido son molidas a polvo fino usando un mortero. Los tejidos de las plantas son más resistentes al tener pared celular, por tanto se utiliza nitrógeno líquido para romper la pared y mantener a los distintos componentes de la célula (proteínas, DNA…) estables en ambiente frio. El polvo se homogeniza mediante el buffer de extracción (EB). Este buffer está formado por: −! 500mM NaCl à฀ Facilita la rotura de la membrana, ya que al introducirlo en la planta provoca la entrada masiva de agua, la cual cosa provocará la lisis celular. −! 100mM Tris-HCl (pH=8) à฀ Tris: buffer (mantiene el pH en el que queramos) =pH= 1011 (muy básico); el DNA se desnaturalizaría. HCl: para rebajar el pH y tener el DNA estable (pH=8)→ con un pH=8 hacemos que el DNA sea más estable. −! 50mM EDTA pH=8 à฀ se trata de un quelante (-); se trata de una molécula que se une a iones con dos cargas (+). Para que las nucleasas (que destruyen el DNA) sean funcionales se deben unir a Mg++ (a iones++) y como estos están unidos a EDTA no serán dañinos para el DNA.

−! 1.5% SDS (sodium dodecyl sulphate) à฀ detergente: para romper membranas y la pared celular. (solubiliza la membrana lipídica). Junto el NaCl destruye las asociaciones no covalentes que mantienen la membrana unida. El DNA entonces puede ser liberado del núcleo.

Para mejorar la rotura celular de las muestras, se incuban a 65ºC. Después de romper las paredes celulares y la membrana plasmática, nos encontramos con una mezcla que contiene restos celulares y componentes intracelulares liberados, una solución compleja de DNA, RNA, proteínas, lípidos y carbohidratos. El siguiente paso es separa el ácido nucleico deseado de estos componentes.

b. Extracción con Fenol – cloroformo à฀ eliminación de las proteínas de las células. - La eliminación de las proteínas es importante ya que la célula contiene un gran número de enzimas que van a degradar el ácido nucleico. - Una forma típica de eliminar las proteínas es por extracción con una mezcla hidrófoba de fenol – cloroformo (previamente equilibrada con buffeer neutro o alcalino). - Si mezclamos mediante agitación un volumen igual de esta solución orgánica con nuestra muestra, las proteínas serán desnaturalizadas

y

precipitaran

en

la

interfase

tras

la

centrifugación. (Esto ocurre ya que el DNA se solubiliza en agua, mientras que las proteínas no son tan solubles en la misma). - El fenol es altamente tóxico por absorción tisular, por tanto, se deben usar guantes durante su uso. Los vapores también son tóxicos mediante inhalación, se debe trabajar en un gabinete de humos. - En el laboratorio se utiliza una mezcla de Fenol – cloroformo – alcohol isoamilo (25:24:1). El alcohol isoamilo es añadido para evitar la formación de espumas en la solución y para ayudar en la separación de la fase orgánica y acuosa. - Si la mezcla de fenol ha sido previamente equilibrada con un buffer neutro o alcalino (como se suele hacer), los ácidos nucleicos (DNA y RNA) permanecerán en la fase acuosa. La fase orgánica se desecha y la fase acuosa se guardó para el siguiente paso. Por otro lado, si se lleva a cabo la extracción con ácido fenólico, el DNA va a permanecer en la fase orgánica y el RNA en la fase acuosa. à฀ Tratamiento con RNAsa: Ahora, la solución acuosa tendrá tanto RNA como DNA. Como a nosotros nos interesa aislar el DNA. Entre dos rondas de extracción con fenol – cloroformo, el RNA indeseado de la fase acuosa se elimina mediante ribonucleasas (RNAsa).

c. Precipitación alcohólica. El DNA es soluble en alcohol.

- Para separar el DNA por precipitación, la fase acuosa se mezcla con un volumen igual con una solución de alcohol, como el isopropanol (2- propanol). Esto hace que el DNA precipite formando un precipitado blanco. - Se realiza una centrifugación para quedarnos con el pellet (DNA). Pero como este pellet también tendrá otros contaminantes como la sal presente en la fase acuosa, se debe lavar con etanol al 70% y resuspender en agua destilada. El etanol disolverá las sales. - Para el almacenamiento del gDNA a largo plazo, se debe mantener a -20ªC. Para pocos días se puede mantener a 4ºC.

2- Cuantificación de DNA mediante análisis espectrofotométrico UV - Después de la extracción del gDNA, se debe estimar el rendimiento de ADN obtenido. - La concentración de una muestra de RNA o DNA se puede comprobar mediante la espectrofotometría UV. Ambos, RNA y DNA absorben luz UV de manera eficiente, haciendo posible que sean detectables y cuantificables incluso a concentraciones tan bajas como 2,5 ng/µl. - Las bases nitrogenadas en los nucleótidos tienen un máximo de absorción de 260 nm. Usando una trayectoria de luz de 1 cm, el coeficiente de extinción de los nucleótidos en esta longitud es de 20.

!"#$%→"'(/*'( !"#+%→,-./0123

1,6 >

𝑂𝐷260 < 2,1 𝑂𝐷280

- Entre 1,6 y 2,1 hay buena calidad, se va hacia valores mayores como 4,5 quiere decir que habrá contaminación por fenol (interactuará con las proteínas). - Utilice H2O o 1X TE como un disolvente para suspender los ácidos nucleicos - Para un 1 cm de paso de luz en la cubeta de cuarzo, la densidad óptica a 260 nm (OD260) es igual a 1,0 para las siguientes soluciones:

- a 50 μg/mL solution of dsDNA - a 33 μg/mL solution of ssDNA - a 20-30 μg/mL solution of oligonucleotide - a 40 μg/mL solution of RNA Ejemplo de cálculo: Una muestra de dsDNA se diluye en 50x. La muestra diluida dio una lectura de 0,65 en un espectrofotómetro a OD260. Para determinar la concentración del DNA en la muestra original, se lleva a cabo los siguientes cálculos: dsDNA concentration = 50 μg/mL × OD260 × dilution factor dsDNA concentration = 50 μg/mL × 0.65 × 50 dsDNA concentration = 1.63 μg/μl RNA concentration (μg/ml) = (OD260)x (dilution factor) x (40 μgRNA/mL)(1

OD260 unit) En contraste con los ácidos nucleicos, las proteínas tienen un máximo de absorción UV de 280nm, debido principalmente a los residuos de triptófano. La absorbancia de la muestra de ADN a 280 nm da una estimación de la contaminación de proteína de la muestra. La relación de absorbancia a 260nm/280nm de la muestra de DNA se usa como índice de pureza del DNA: éste debe estar entre 1,6 y 2. La relación 260/280: cuando el DNA es aislado, con frecuencia quedan proteínas presentes en la solución de ADN, las proteínas se unen fuertemente al DNA y la eliminación completa de la proteína no siempre es posible. Tando la proteína como el ADN absorben la luz UC, pero tienen diferentes curvas de absorbancia.

El pico de absorbancia de la luz es 260 nm para el DNA y 280 nm para la proteína. Para una buena preparación de ADN de la gama del índice debe estar entre 1,8 y 2. El fenol tiene un máximo de absorbancia de 270nm pero el espectro de absorbancia se superpone considerablemente con la de los ácidos nucleicos. Si hay contaminación de fenol en su muestra de ADN, la absorbancia a 260nm será alta, dando una medida falsa de la concentración de ADN.

II- SOUTHERN BLOT El análisis de gDNA se realiza por análisis de transferencia de Southern, que se utiliza para estudiar cómo se organizan os genes dentro del genoma por sitios de restricción de mapeo en y alrededor de los segmentos de gDNA. •! El método de southern blot se utiliza en el estudio para ver la presencia de

genes específicos i para ver como estos están organizados en el genoma. Puede detectar la secuencia de DNA utilizando enzimas de restricción y básandonos en los fragmentos del genoma. •! El método lleva el nombre de su inventor, el biólogo británico Edwin Sur. •! Básicamente se utiliza para estudiar:

o! La presencia de genes específicos o! Como los genes están organizados en el genoma: §฀! Número de copias de un gen endógeno §฀! Los sitios de integración del transgen DNA à฀ Southern blot RNA à฀ northern Proteins à฀ western Glycosilation pattern à฀ Eastern

à฀ PRINCIPIO DEL ANÁLISIS SOUTHERN BLOT:

1. Mediante el uso de enzimas de restricción (endonucleasas) se digiere el DNA genómico. Generalmente una enzima de restricción se utiliza para romper las cadenas de DNA en fragmentos. La elección de la enzima depende de la finalidad del análisis, tales como el estudio de: -!

El estudio del número de copias de un gen de interés, normalmente un gen endógeno.

-!

Para estudiar la integración de un transgen en el genoma del organismo transformado: o! Presencia de las secuencias de interés o! Número de lugares donde se integre

-!

Estudio de la metilación de genes (análisis epigenético): La epigenética se refiere a las moficiaciones de ADN y cromatina, que persisten de una división celular a la siguiente a pesar de una falta de cambio en la secuencia de ADN subyacente. Algunos cambios epigenéticos muestran significado de herencia transgeneracional; estos cambios se pueden pasar de una generación a la siguiente. La epigenética juega un papel importante en la diferenciación celular.

- Componentes necesarios para la digestión: a. Autoclave con H2O destilada. Es bueno añadir el buffer y el agua en el tubo primero. Si se pone la enzima antes que el agua, debido a la alta concentración de sales, esta puede desnaturalizarse irreversiblemente. b. Buffer; dependiendo de la enzima. · Se trata del buffer 10x que viene con la enzima de restricción. (diluido 10 veces) · Componentes: - Tris (agente tampón que mantiene el pH constante) - Sales (normalmente NaCl o KCl) que proporcionan la fuerza iónica apropiada para la digestión. - Mg++ (del MgCl2) que es necesario como cofactor para la actividad enzimática. c. DNA (de 10 – 25 µg) El valor de la relación OD260/OD280 debe estar en el rango apropiado, ya que los contaminantes en la muestra de ADN pueden interferir con la actividad enzimática. Ej: El arroz tiene 400 Mbases =13 microgramos; El trigo tiene x 33 x400 = 25 microgramos. d. Enzimas - Se selecciona en función de nuestro transgen. - En general la concentración de enzima es de 10 unidades/µl. Una unidad se define como: la cantidad de enzima que se necesita para digerir 1 µg de virus bacteriano

lambda de DNA en 1h en una reacción de 50µl. (Para estar seguros de que va a ser eficaz, se pondrán en exceso). ej: para 13 microgramos de DNA se necesitarían unas 100 unidades de enzima para tener una digestión eficaz. !!! No se debe usar más del 10% de enzima del volumen de reacción final. Esto es debido a que el buffer contiene anticongelante (glicerol) y si hay demasiado glicerol se inhibirá la reacción de digestión. Condiciones especiales requeridas por algunas enzimas: -!

BSA (albumina serum bovina): estabiliza la enzima en la reacción y puede inhibir algunos contaminantes que estén presentes en preparaciones de DNA uniéndose a ellos.

-!

Detergentes: algunas enzimas requieren de detergentes débiles para reducir la tensión superficial.

-!

Tª de incubación: algunas enzimas no son activas a según que temperaturas. Por tanto se deben incubar a temperaturas diferentes de 37ºC.

-!

Condiciones óptimas de digestión: se debe tener un volumen de unos 300µl para poder poner DNA y que se realice correctamente la digestión. Se deja a 37ºC durante la noche. La eficiencia de la digestión se comprueba mediante la ejecución de una electroforesis de una alícuota.

2. Separación de los fragmentos digeridos por electroforesis Antes de la separación de los fragmentos de ADN digeridos en el procedimiento de transferencia de Southern, se necesita comprobar la eficiencia de la digestión del DNA y para ello usamos un minigel mediante la carga de una parte alícuota de la digestión. Después se realizará un southern blot con un gel grande (apropiado) para poder observar mejor las migraciones de los fragmentos en el gel (migración lenta para optimizar la separación de todos los fragmentos; que se realiza durante la noche). Cuanto mejor se la separación, más fácil será luego detectar el gen de interés reconocido por una sonda específica (hibridación) · Se hacer con un gel de agarosa al 0’8% para la electroforesis que realizaremos a los fragmentos digestionados en el paso anterior.

SMEAR

3. Etapa pre-blotting (Desnaturalización in situ) No se puede hibridar una sonda a fragmentos de ADN mientras están en un gel de agarosa, por tanto, se deben transferir a un soporte sólido. Pero antes de realizar la transferencia se deben hacer 3 tratamientos sucesivos: a. Depuración parcial usando HCl a 0,25M: aumenta la eficiencia de la transferencia de largos fragmentos de DNA (>10kb). Como no queremos destruir el DNA sino solamente depurificarlo se hace en un tipo corto, de aproximadamente 7 minutos. Además, la depurificación retira algunas purinas, y corta el DNA en fragmentos pequeños. Todo esto facilitará la transferencia del gel al soporte sólido. Cada fragmento es dsDNA. b. Desnaturalización. El objetivo es reorganizar la secuencia mediante hibridación, para ello dsDNA à฀ ssDNA. Hacemos una desnaturalización. La desnaturalización se puede hacer mediante el ↑ Tª o condiciones básicas. Pero no se debe hacer un↑ de Tª por tanto debemos hacerlo con una solución básica (NaOH a 0’5M/NaCl 1,5M). Durante este paso, se aumenta el pH, por tanto el ADN estaría en condiciones no estables (dsDNA desnaturalizado). *Para evitar la repulsión de cargas negativas que podrían mover la posición de los fragmentos, se utiliza NaCl, cosa que evitará las repulsiones del DNA. Por la cual cosa, una vez separado el DNA, debemos encontrar una condición en que el DNA esté estable. Para ello lo que hacemos es una: c. Neutralización del DNA con el buffer tris a 0’5M que nos dejará un pH=6,5)

4. El DNA ahora ligado a la membrana se hibrida (Prode= sonda) Mediante el uso de una sonda de naylon.

Las membranas de Nylon serán el soporte sólido con carga + donde podrá unirse el DNA tanto de cadena simple como de doble cadena. El buffer de transferencia 20x SSC (Standard Saline Citrate) contiene 3M NaCl + 0’3M citrato de sodio a un pH=7. Este buffer proporciona un nivel de sal alto que necesita para la transferencia del DNA. Una membrana de nylon (filtro) se coloca sobre el gel y una pila de toallas de papel secas en la parte superior del filtro. Un buffer de transferencia se filtra a través del gel por acción capilar y se lleva los fragmentos de ADN con él. Están atrapados en la membrana, que adquiere así un patrón de bandas de ADN que corresponden a la posición de los fragmentos en el gel de agarosa. Un peso aplicado a la parte superior de las toallas de papel ayuda a asegurar una conexión hermética entre las diferentes capas en el sistema de transferencia. La transferencia capilar procede durante la noche.

After blotting Después de la transferencia de DNA, éste se inmoviliza sobre la membrana usando irradiación UV. UV cross-linking cauda la formación de enlaces covalentes entre los grupos químicos de las membranas y los residuos de timina. También se puede inmovilizar mediante un tratamiento al horno a 80ºC durante varias horas, pero el UV cross-linking es más conveniente y más rápido, pues tarda solamente 1 minuto.

Una vez que el DNA está fijado, la membrana se lava con tampón de transferencia diluido para eliminar el exceso de sal presente en el tampón de transferencia.

En este punto, el blot puede ser: -!

Utilizado para la hidridación con una sonda específica

-!

Almacenado a 4ºC para su posterior hibridación

III- HIBRIDACIÓN CON UNA SONDA ESPECÍFICA Podemos

utilizar

el

fenómeno

de

hibridación para identificar un fragmento específico

de

ADN

mediante

el

etiquetado de una secuencia de ADN específica (la sonda), y la mezcla de la sonda marcada con los fragmentos de ADN

desnaturalizados

fijos

sobre

la

memebrana. Esto permite al investigador, determinar la presencia y localización de fragmento de DNA en particular (por ej, el gen de interés) que es complementario a la sonda.

El gDNA y la sonda son ssDNA con el objetivo de permitir la hibridación entre el ADN diana y la sonda marcada. Es mejor el uso de una sonda de unos 300-600bp (ss para poder

hibridar).

a. Marcaje de sonda Se utilizan diferentes tipos de marcaje de sondas DNA:

1. Marcaje de sonda radioactivo: - Normalmente se sintetizan in vitro y se componen de un número apropiado de residuos de desoxirribonucleótidos marcados radiactivamente. - Por lo general, un tipo de dNTP radiactivo se incluye en la reacción junto con no marcados dATP, dTTP, dGTP y dCTP.

- El isótopo utilizado con mayor frecuencia esl el P-32, ligados covalentemente a través de un enlace fosfodiéster al C5’ de los residuos de ribosa. Se detecta con un film de rayos X. - La desintegración del radiosiótopo dentro de la sonda emite energía (en su mayoría β-partículas), que identifica la ubicación de la sonda cuando se detecta por la exposición de la membrana a la película de rayos X.

2. Marcaje de sonda no radioactivo: en vez de usar radioactividad se utiliza una enzima ligada directamente o indirectamente a la sonda. (indirectamente se usa un antígeno mediante el cual se producirá un producto que emitirá bioluminiscencia). - Marcaje directo: la sonda puede estar vinculada directamente a una enzima tal como fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano picante (HRP). - Marcaje indirecto: la sonda está unida a un resto químico adecuado, tal como la biotina o digoxigerina (DIG).

b. Sistema de marcaje con DIG El

proceso

de

detección

requiere

la

adición de un reactivo secundario que tiene una afinidad muy elevada por la estructura química de la sonda, anticuerpo antidigoxigenina. conjugado

con

El la

anticuerpo fosfatasa

está

alcalina.

Entonces el producto de la reacción emitirá luz que será la señal que seremos capaces de detectar. - Generación de la sonda de marcaje DIG: La forma más fácil para producir una sonda marcada con DIG es llevar a cabo una incorporación de la DIG durante la PCR:

El kit de PCR para la síntesis de la sonda DIG (Roche) incluye: -!

PCR buffer con MgCl2

-!

Taq DNA polimerasa

-!

Mezcla de dNTPs marcados y sin marcar con DIG

Un conjunto específico de cebadores está diseñado para amplificar un fragmento de ADN (dentro de la secuencia del gen de interés por ejemplo). Como molde usamos un plásmido que lleva el fragmento de interés. La digoxigenina-11dUTP incluido en la mezcla de dNTPs se añade a la hebra sintetizada durante la PCR. La sonda resultante es muy sensible.

Las sondas generadas con este método se pueden usar para detectar genes de una única copia en el procedimiento de transferencia de Southern genómico. Podemos detectar hasta 0,01pg de ADN inmovilizando sobre la membran...