ED Méthodes d\'analyse des Protéines() PDF

Preview

Summary

...

Description

Méthodes d'analyses des protéines = Une cellule contient des milliers de protéines différentes. Pour étudier une protéine il faut la séparer des autres protéines cellulaires et la purifier. 3 étapes : 1.

Extraction des protéines de la cellule

= Mise en solution de la protéine = techniques de solubilisation ▪ des caractéristiques mécaniques du tissu de départ ▪ de la localisation IC de la cellule : ex protéines cytoplasmiques facilité d’extraction par rapport à celles contenues dans les organismes cellulaires. =Obtention d'un extrait brut : contient toutes les protéines de ce type de cellule ou du tissu 1. Séparation et purification des protéines = Méthodes de séparation des protéines en fonction des propriétés physico-chimiques des protéines. 2. Mise en évidence de la protéine et/ou quantification d'une protéine individuelle à l'issu purification

 Extrait tissulaire ou cellulaire, solubilisation de la cellule, séparation et purification des protéines contenues dans ces cellules Techniques d'analyses en fonction de la protéine et/ou quantification d'une protéine individuelle à l'issue purification :

Caractéristiques solubilité charge ionique caractère polaire taille moléculaire spécificité liaison

Techniques 1. Solubilisation / précipitation saline 1. Chromatographie par échange d'ions 2. Électrophorèse 3. Focalisation iso-électrique 1. Chromatographie d'absorption 2. Chromatographie en phase inverse 3. Chromatographie par interactions hydrophobes 1. Dialyse et ultrafiltration 2. Électrophorèse en gel 3. Chromatographie par fixation sur gel 1. Chromatographie d'affinité

I . Techniques de solubilisation 1.

Lyse osmotique

= cellules dans milieu hypotonique (pression dans la cellule beaucoup plus élevée que dans le milieu dans lequel les cellules se trouvent) + Triton ou Tweed (=détergents non ioniques) => Éclatement/rupture des cellules Rôle des détergents non-ioniques : Déstructurer la membrane cellulaire contenu de la cellule répandu dans le milieu. 2.

Digestion des parois bactériennes avec le lysoenzyme

Libération du contenu des organites avec le lysoenzyme, qui va dégrader les membranes des organismes cellulaires libérant le contenu des organites. 3.

Traitement mécanique

= Elle permet de séparer et analyser les constituants d'un mélange en le faisant circuler à travers la colonne contenant un support solide poreux, inerte = la phase stationnaire (PS) à l'aide d'un solvant mobile (gaz, liquide) qui l'entraine. = En fonction de leur solubilité dans la phase mobile et de leurs interactions avec PS, chaque constituant adopte une vitesse de migration qui lui est propre • Broyage en présence sable • Utilisation d'un homogéneiseur, d'un sonicateur (permet de faire éclater les cellules grâce à des ultra-sons). • Centrifugation du lysat : reste dans le tube les phases aqueuses au-dessus, les débris au fond. Partie aqueuse contient les protéines.

II . Techniques de séparation et de purification A- Chromatographie Technique qui permet de séparer et d’analyser des constituants d’un mélange en le faisant circuler à travers une colonne qui va contenir un support solide poreux et inerte, non modifié, appelé phase stationnaire. Les constituants du mélange vont circuler dans la colonne à l’aide d’un solvant mobile (gaz ou liquide) qui va entrainer les protéines vers le bas de la colonne. Permet de séparer et d’analyser les constituants d’un mélange, en le faisant circuler dans la colonne avec un support solide/poreux/inerte après la phase stationnaire et un gaz solide ou liquide va entrainer le mélange dans cette colonne. En fonction de leur solubilité dans la phase mobile et de leurs interactions dans la phase stationnaire chaque protéine va adopter une vitesse de migration qui lui est propre.

 Selon la vitesse : détermination de la protéine, Variation de la vitesse selon : - contenue de la colonne - Différence de technique 1.

Chromatographie par échange d'ions

= Les ions sont liés électrostatiquement à un support insoluble et chimiquement inerte (phase stationnaire formant une résine) sont déplacés par les protéines (colonne constitué de résine chargée ici + les ions - vont se fixés sur la résine) les protéines vont pousser les anions pour être remplacés de manière réversible par des ions en solution. Récupération de la solution sans les protéines – mais avec les anions, la protéine à analyser se trouve dans la résine Ex « échangeurs anions » : Résine + A-

+

Protéine -

échangeur anions

>>> Résine + Protéine -

+

A-

pH>pHi

• Les échangeurs d'ions = Groupe chargé liés par covalence à une matrice support. • Matrice support d'échangeurs d'ions = • des résines : cellulose, gel de polyacrylamide • dérivés de silice, billes de verres enrobées. • Une protéine : ◦ a une charge + au pH < pHi ◦ a une charge – au pH> pHi Rappel : pHi = isoélectrique = charge globale nulle. • ◦ ◦

Elle peut donc être retenue suivant le cas sur : Un échangeur de cations = C+ = gel porteur charges fixes + Un échangeur d'anions = A- = gel porteur charges fixes -

Étapes : 1. Mise en solution des protéines dans une solution où pH et la [sels] tels que la protéine est immobilisée sur l'échangeur d'ions choisi. 2. Injection de la solution en haut de la colonne 3. Liaison des protéines et a.a à l'échangeur d'ions avec des affinités différentes 4. Elution : lavage de la colonne avec des solutions tampons de pH et de concentration salines différentes = + l'affinité de la molécule pour l'échangeur est forte, + sa migration est retardée. 2. Chromatographie par fixation sur gel = Chromatographie par exclusion = Tamissage moléculaire > Les protéines sont séparées selon leur taille et forme •

PS : billes de gel dont les pores ne laissent passer que des molécules de petite

taille • ◦ ◦ ◦

Les gels : Dextron (séphadex) Agarose Polyacrylamide

– –

Les grosses molécules sont éluées en premier Les petites à l'intérieur des billes de gel = sont retardées.

3. Chromatographie par affinité = Repose sur la relative spécificité d'interaction d'une protéine sur certains ligands. Gel constitué de ligands • Injection de la solution protéique en haut de la colonne • Liaison de la protéine d'intérêt au ligand (les autres ressortent directement) • Elution de la protéine d'intérêt ◦ Par lavage avec une solution d'un composé qui a une + forte affinité pour la protéine que le ligand ◦ Ou Par modification des propriétés de la solution = pH, température, force ionique, afin de déstabiliser le complexe ligand/protéine. Phase stationnaire contient une résine formée de ligands spécifique d’un type de protéine donné, ici seules les protéines ayant des affinités avec les ligands vont se fixer à celui-ci.

B. Électrophorèse = Séparation de solutés chargés par migration dans un champ électrique (CE)

> Les protéines ionisées donc chargées, placées dans un CE, se dirigent vers l'électrode de signe opposé à leur charge. Si chargé – migrent vers l’anode sinon migrent vers la cathode > La vitesse de migration V est fonction : • intensité CE : E • charge électrique globale protéine : z • coefficient de friction : f (dépend de la masse moléculaire en migration et viscosité du milieu) 1.

Électrophorèse sur gel a ) Principe

(schéma) • Introduction du gel dans plaque verticale • Dépôt des différentes solutions de protéines dans les puits du gel (en haut) • Fermer la chambre du gel avec un couvercle • Appliquer une DDP ◦ La protéine chargée – migre vers l'anode située à la partie inférieure du gel (schéma) = L'action du tamisage du gel de polyacrylamide sépare les v = Ez / f protéines en fonction taille, … • ◦ ◦ ◦

Migration dépend : charge protéine taille support (gel +/- réticulé, papier)

• L'électrophorèse sur gel = inverse de la filtration du gel aux solutions protéiques (les protéines passent dans les trames du gel et non dans les pores). Ce gel est imperméable aux solutions protéiques. Les molécules les plus petites se déplacent plus rapidement que

les molécules les plus grosses (gel : tamis moléculaire)

• •

b) Les gels (deux types) Polyacrylamide Agarose c) SDS-PAGE

SDS = Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel électrophoreisis SDS : • Détergent ionique qui rompt liaisons non covalentes des protéines natives • Se lie très fortement aux protéines en leur conférant une forme de bâtonnet, linéaire • Apporte une très forte charge – à la protéine => Séparation des protéines en fonction de la masse moléculaire, par effet de filtration sur gel. = La mobilité électrophorétique de nombreuses protéines en gel de polyacrylamide SDS et inversement proportionnelle à leur masse.

Application SDS PAGE : détermination masses moléculaires • protéines normales • des s-u protéiques dénaturées par SDS (cf schéma) > Dépose échantillons protéiques > Séparées en fonction PM d) Détection des bandes de gel +/- et quantification ➢ Par coloration • Bleu de coomassie qui colore en bleu • Amideschwartz (noir) • rouge ponceau > Intégration des bandes séchées au densitomètre On va intégrer les bandes séchées au densitomètre pour quantifier la protéine. Plus la densité est élevée plus il y a des protéines. Application électrophorèse aux protéines sériques: • A pH = 8.6 (pH> pHi de toutes les protéines sériques) • toutes chargées - : migration de cathode vers anode.

La protéine la plus grosse est restée en haut : l’albumine et c’est la plus abondante dans le sérum Alpha globuline 1 et 2 Les gamma globulines sont les plus petites. On peut connaitre les différentes concentrations des différentes globulines Approche qualitative = aspect tracé électrophorètique Approche quantitative Détection des bandes et quantification par coloration ou par immunotransfert, immunologie au western blot

2. Focalisation isoélectrique = électro iso-phocalisation =Mode de séparation en fonction du pHi (pH où la charge globale est nulle) • Un gradient pH est établi dans un gel avant chargement de l'échantillon • Dépôt de l'échantillon • Application d'une DDP sur le gel • Migration des protéines vers leur pHi, là où elles n'ont pas de charge globale (où pHi=pH) ◦ Formation de bandes (protéines avec le même pHi)

= Les protéines forment des bandes qui peuvent être découpées et utilisées pour une utilisation ultérieure.

3. Électrophorèse sur gel en 2 dimensions (2D) = Eléctrophocalisation + SDS polyacrylamide • Fractionnement de l'échantillon de protéines dans une dimension par électrofocalisation • Accolement du gel d'électrofocalisation à un gel de SDS polyacrylamide • Réalisation d'une électrophorèse dans une 2e dimension perpendiculaire (verticalement) à la 1ere séparation. (cf schéma) = Les protéines possédant le même pHi sont alors séparées selon leur masse.

III. Techniques de mise en évidence et/ou quantification = Dosage ou mise en évidence des protéines d'intérêt • Au cours du processus de purification ◦ intérêt : vérifier la stabilité de la protéine ◦ protéines enzymatiques : déterminer des activités enzymatiques ◦ autres protéines : ▪ capacités à se lier à des molécules spécifiques (=ligands) comme par exemples des récepteurs. ▪ Méthodes de dosage colorimétriques : biuret, lowry. • Plus il y a de protéines, plus l’intensité de coloration est forte : on passe d’un bleu clair à un violet foncé. •

A l'issue de la purification : techniques immunologiques

– Techniques immunochimiques sont très sensibles et spécifiques. Outils pour :

purification des protéines localisation cellulaire son dosage -

Fondées sur la spécificité des Ac pour leurs protéines cibles Ac polyclonaux Ac monoclonaux qui sont plus spécicifiques que les Ac polyclonaux (cf schéma Ac) = Des protéines, AN, ou polysaccharides peuvent être des Ag Principe : Détection directement de la protéine en la protéine en la faisant directement précipiter avec ces Ac ou indirectement par dosage immunologique.

A. Tests immunologiques 1. • •

Méthode dite de « compétition » Dite « en défaut d'Ac » Les Ac fixent tous les Ag quels que soit leur taille

Ac fixé limitant + Ag à dosé + Ag marqué(=même affinité avec Ac) → Marqueur lié + Marqueur libre L’Ag à doser entre en compétition avec l’Ag marqué pour la liaison à l’Ac. Ils ont autant d’affinités pour ll’Ac marqué que pour celui à doser. Toutes lesprotéines ou Ag qui n’ont pas fixé d’Ac vont sortir et on va quantifier le nombre d’Ag marqué. la totalité des sites disponibles est liée. Moins il y aura d’Ag marqué qui sortent, plus il y aura d’Ag marqué fixé aux Ac. En connaissant le nombre d’Ag marqué et le nombre d’Ac on pourra connaitre le nombre d’Ag à doser. On mesure la fraction liée qui diminue exponentiellemnt avec la concentration en Ag à doser. = cf diagramme non proportionnel

2. Méthode Sandwich Méthode immunométrique à deux sites Ac : l’Ag est pris en sandwich entre les deux Ac Pour toute molécule de PM suffisamment élevé : protéines +++, hormonologie. Ac fixé en excès + Ac à dosé → Ac marqué → marqueur lié + marqueur libre

= cf diagramme proportionnel On quantifie le nombre d’Ac marqué qui ont fixé les Ag. (pour les deux méthodes) : Protéines marquées par traceur : • Radio marqué • Enzyme • Fluorescent (molécule) • Luminescent B. Western blot = Électrophorèse + immunoanalyse = Révélation d'une protéine à l'aide d'un Ac spécifique (cf schéma) • Électrophorèse en gel SDS poLyacrylamide de l'échantillon • Transfert des bandes protéiques du gel par blotting sur une feuille de nitrocellulose, recouvrir le gel d'une feuille de nitrocellulose et comprimer l'ensemble avec objet pesant. Ce qui va nous permettre de transférer les protéines du gel sur la feuille de nitrocellulose. • Saturer les sites de liaison inoccupés de la nitrocellulose avec de la caséine • Incuber avec les Ac de lapin digérés contre protéine d'intérêt (primaire => rouge) • Laver puis incuber avec un Ac secondaire (bleu) qui est dirigé contre les Ac anti lapin (rouge) et auquel l’Ac bleu est lié par covalence une enzyme facile à doser • Laver et mise en évidence de enzymologie, de la quantité de protéine grâce à réaction colorée.

CONCLUSION = • Purifier une protéine : libérer la protéine de la cellule (solubilisation) puis mettre en œuvre de façon séquentielle plusieurs techniques de séparation. Objectif purification : obtention d'une protéine de plus en plus pure pour étudier

spécifiquement sa structure, sa fonction. Au cours du processus de purification, vérifier que la protéine ne soit pas dénaturée. A l'issue purification, dosage quantitatif de la protéine. • Cas particulier des protéines sériques : étape de solubilisation n'est pas nécessaire. Techniques en biologie médicale = électrophorèse des protéines sériques. Choix des techniques de séparation en fonction des propriétés physicochimiques des protéines et de la quantité d'extrait brut à analyser....