Estructura Bacteriana. Observacion Microscopica DE Bacterias resumen PDF

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Resumen para test de laboratorio de microbiologia general...

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OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS A. Observación de bacterias vivas: Al fresco, el cual se realiza en un caldo de cultivo, agua o suero fisiológico. El cual permite la observación de bacterias en estado vivo en el microscopio. Las cuales se disponen un portaobjeto con un aumento de 10x o 40x. bajando el condensador y disminuyendo la luz Importante: Acá podemos observar la movilidad del microorganismo En campo oscuro, usado para la visualización de bacterias muy pequeñas Ej: treponema pallidum. Con un condensador especial distinto al del microscopio convencional. El cual envía la luz de la lampara del microscopio de tal manera que, no incide directamente en la preparación. Por lo que los microorganismos observados presentaran cuerpos brillantes con un fondo oscuro B. Observación de bacterias fijas en estado muerto: en su mayoría requieren uso de tinción. Por lo que las bacterias en consecuencia mueren. Al hacer uso de tinción sobre las bacterias. Es más fácil observar la forma y el tamaño con un objetivo de 100x. el cual utiliza aceite de inmersión en la preparación. Importante: estas tinciones ofrecen datos importantes como la pared celular que posee la bacteria. Esto adicional a morfología que ya poseen. Tipos de tinciones: 1. Tinción de Gram 2. Tinción con verde malaquita 3. Tinción con tinta china Cosas que uno puede encontrar en estas tinciones son: 1. Esporas bacterianas (2) 2. Capsulas (3) Como preparar un frotis bacteriano: ¿Qué es un frotis? Es una extensión que se realiza sobre un portaobjeto con el objetivo principal de teñir los microrganismos Etapas de un frotis: A. Extensión: 1. Caso de una colonia bacteriana: suspender las bacterias a observar en un liquido 2. Cultivo liquido: agregar una gota del caldo de cultivo Para ambos casos se deposita con una pipeta Pasteur sobre el portaobjeto, se extiende el fluido con la ayuda de un asa B. Secado C. Fijación: la adhesión pude hacerse a través de dos medios. 1. Medio físico: dejar el extendido al calor 2. Medio químico: se deja el extendido que actúe con un agente químico ej: alcohol metílico, éter Para la realización de un frotis se procede del siguiente modo: a) Prenda el mechero (recuerde trabajar en la zona estéril, calentando el asa al rojo entre un uso y otro). Asegúrese que el portaobjetos está completamente limpio b) Coloque una gota de agua o suero fisiológico en el centro de la lámina (sólo si la muestra o cultivo es sólido)

c) Transfiera con un asa estéril una, dos o tres colonias (depende del tamaño) y mézclelas con el agua formando una suspensión apenas opalescente. Deje secar al aire d) Fije el frotis exponiéndolo brevemente a la llama del mechero hasta que esté completamente seco. Evite que se recaliente, pues se alterará la morfología bacteriana (y corre el riesgo de quebrar la lámina de vidrio). Compruebe el calor del portaobjetos sobre el dorso de su mano. Una vez extendida y fijada la preparación se deja actuar sobre ella los colorantes de uso microbiológico. Tinciones de uso microbiológico: se deja actuar una solución de colorante sobre la preparación ya fijada. En estas soluciones varían de acuerdo con el tipo de tinción que se usa. A. Tinción simple: se usa colorante sobre el frotis bacteriano. Por lo que las bacterias observadas serán de un único color. Esta tinción exclusivamente sirve para la observación de forma y agrupación de bacterias Procedimiento 1. Realice un frotis de la muestra. Asegúrese de fijarlo correctamente. 2. Ubique el portaobjetos en la zona de tinción. Vierta sobre la muestra el colorante escogido, déjelo actuar por 1 ó 2 minutos. 3. Lave suavemente el frotis con agua. 4. Seque el portaobjeto inclinándolo sobre papel absorbente para que escurra el agua. Luego puede pasarlo rápidamente por la llama del mechero para que quede completamente seco. 5. Observar al microscopio, con objetivo de inmersión. B. Tinción diferencial: son tinciones que hacen uso de mas de un colorante. Por lo que las bacterias se tiñen de diferentes colores de acuerdo con la afinidad que tienen por el mismo. Se establece que, la afinidad por la tinta está relacionada con la propiedad del grupo bacteriano, como la estructura a nivel de la pared bacteriana. De este modo se puede agrupar las bacterias que quedan teñidas de un mismo color Tinciones más relevantes: tinción de Gram, tinción de Ziehl- Neelsen Aspectos de la tinción de Gram: nos permite diferenciar al menos dos grupos bacterianos basados en la afinidad que tienen por el colorante Cristal violeta: gram positivas, color azul violeta, Capa gruesa de peptidoglican, no tienen membrana externa que rodee a la bacteria Safranina: gram negativas, color rojo, capa delgada de peptidoglican, poseen una membrana externa que rodea a la bacteria Gram Variable: simultáneamente presenta la tinción de gram positiva y tinción de gram negativa. Poseen una pared con estructura de gram positiva, posee una capa de peptidoglican más delgada que las mayorías de las gram positivas Procedimiento 1. Prepare un frotis. 2. Cubra toda la muestra con Cristal Violeta o Violeta de Genciana al 1%, deje actuar durante 1 minuto. 3. Elimine el exceso de colorante y lave con agua rápida pero cuidadosamente, manteniendo la lámina inclinada. 4. Cubra la preparación con la solución de Lugol, deje actuar durante 1 minuto 5. Lave con agua.

6. Decolore con alcohol etílico o alcohol-acetona durante 30 segundos 7. Lave con agua. 8. Cubra el portaobjetos con safranina, deje actuar por 30 segundos 9. Lave con agua. 10. Seque la lámina en forma inclinada sobre papel absorbente. Cuando esté completamente seca, puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (100x) agregando una gota de aceite sobre el portaobjeto. Principios de la tinción de gram A. Tinción inicial: se tiñen las células con el colorante primario que seria cristal violeta. Importante en este paso totas las células se tiñen de un único color (azul violeta). B. Mordiente: Adición de Lugol con el cristal violeta para formar un complejo insoluble en agua. Importante: todas las células siguen con coloración (azul violeta) C. Decoloración: adición de un solvente orgánico (alcohol/ acetona). El cual actúa lavando el complejo de cristal violeta/lugol en las células gram negativas Importante: las células gram negativas quedan incoloras y las gram positivas quedan de azul violeta. Punto crítico: si el procedimiento se hace en un tiempo muy breve no se lograrán decolorar las gram negativas y si el procedimiento se hace de manera exagerada puede que se decoloren las células gram positivas. D. Tinción de contraste: se adiciona un colorante distinto al colorante primario que anteriormente ha sido removido por la acción del solvente orgánico sobre las células gram negativas. Acá se usa el colorante safranina que tiñe a las células de color rojo. Importante: las gram positivas son resistentes al lavado del complejo insoluble en agua.  La retención o perdida del colorante depende de la estructura de la pared que posee la bacteria, en el cual se forma el complejo de cristal violeta/lugol.  Bacterias que carecen de capa externa y que poseen una capa gruesa de peptidoglican retienen el colorante primario (cristal violeta)  Bacterias que poseen una capa externa gruesa y poseen una capa muy delgada de peptidoglican pierden el colorante primario y solo retienen la tinción de contraste (safranina) Aspectos de la tinción de Ziehl-Neelsen: nos permiten colorear bacterias que son difíciles de teñir con colorantes básicos (cristal violeta). Ya que estos no penetran la bacteria. A través de colorantes enérgicos como fucsina fenicada, el cual es capaz de entrar a la bacteria con el uso del calor o el tiempo prolongado de contacto con el fin de retener el colorante. Por lo que, los decolorantes fuertes como alcohol y ácidos no son capaces de decolorar las bacterias. Por eso se llaman Bacterias Acido Resistentes (BAAR). Importante: su uso se limita a bacterias que poseen un alto contenido lipídico, las cuales se caracterizan por ser difíciles de teñir. Bacterias Mycobacterium son BAAR pues presentan principalmente fosfolípidos y ceras que componen un 40% de su peso seco. El colorante base de la tinción Ziehl-Neelsen es la fucsina fenicada y como decolorante se usa ácido clorhídrico al 3% en alcohol etílico. El colorante de contrate es azul de metileno, pero se puede usar también verde malaquita o amarillo victoria. Procedimiento 1. Realizar un frotis con material biológico del paciente, obtenido de zonas que contienen bacterias, como expectoración u orina. La muestra de expectoración se extiende sobre el portaobjetos de manera homogénea

(se puede utilizar otro portaobjetos para extenderla) cubriendo las 2/3 partes de la lámina, para luego fijar con calor. La muestra de orina debe sedimentar, el sedimento se centrifuga a 1.500 r.p.m. durante 5 minutos. El frotis se realiza utilizando el pellet; y se debe fijar en la estufa. Esta misma operación se realiza con otros líquidos corporales, como L.C.R. o líquido pleural. 2. Luego de realizado el frotis, se cubre la lámina con fucsina fenicada (previamente filtrada) y se calienta hasta que emita vapores blanquecinos visibles. Repetir este proceso dos veces más, evitando que el colorante se seque sobre la lámina. Contabilizar un tiempo total de actuación del colorante de 8 a 10 minutos. Cuando aparecen vapores se ha logrado el calentamiento aproximado de 90°C con lo que se obtiene una cubierta cérea más blanda que se deja impregnar por el colorante. 3. Eliminar la fucsina inclinando el portaobjetos hacia adelante, lavar el frotis con un chorro de agua suave sobre la parte del portaobjetos que no contiene extendido y dejar escurrir el agua sobre la película coloreada de modo que ésta no se desprenda. 4. Cubrir la totalidad de la lámina con alcohol-ácido de manera que vaya decolorando y arrastrando suavemente la fucsina hasta que las partes más gruesas del extendido conserven sólo un ligero tinte rosado. Eliminar el alcohol-ácido y lavar con agua. 5. Cubrir la lámina con azul de metileno durante 1 minuto. 6. Eliminar el azul de metileno y lavar con agua a baja presión por ambos lados. 7. Secar a temperatura ambiente. También puede realizarse la técnica en frío, sin necesidad de calentamiento, dejando actuar el colorante durante30 minutos. Las bacterias alcohol-ácido resistentes son aquellas que no pierden la coloración inicial con fucsina por acción del alcohol-ácido y se observarán de color rojo, mientras el resto de la preparación se observará de color azul. Aspectos para tinciones especiales: tienen como función destacar constituyentes de la bacteria como, flagelo, esporas, capsulas o gránulos intracitoplasmáticos. Estos procedimientos son complejos, pero nos permiten precisar detalles de la estructura bacteriana. Esto resulta útil en trabajo de investigación bacteriológica. A. Tinción para capsulas: se hace uso de la tinción negativa que permite determinar la presencia de capsulas polisacáridos a través del uso de la tinta china. Procedimiento a) Coloque una gota moderada de tinta china sobre una lámina y emulsione sobre ella la bacteria en estudio. b) Extienda la suspensión de manera que el frotis resulte delgado. c) Deje secar y fije. d) Cubra con fucsina o safranina. e) Lave, seque y observe con objetivo de inmersión. B. Tinción para esporas: géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como forma de resistencia a las condiciones climáticas adversas o por falta de nutrientes. Estas endosporas se caracterizan por ser resistente al calor, radiación y desecación. Esto se debe a la estructura de la capa externa compuesta de aminoácidos azufrados. Esto también los hace resistente a tinción por lo que es importante que se haga uso del calor para la tinción.

Morfología celular bacteriana las cuales pueden presentar una morfología muy variable y se pueden clasificar de la siguiente forma: 1. Cocáceas: bacterias con forma esférica o aproximado. 2. Bacilos: bacterias de las cuales uno de sus ejes es mayor que el otro, adoptan una apariencia de bastón o un cilindro 3. Espirales: bacterias que presentan una torsión alrededor de su eje central. Parecido a una cola de cerdo. 4. Espiroquetas: bacterias que presentan múltiples torsiones. Muy parecido a una serpentina 5. Curvas: bacterias retorcidas pero que no alcanzan a llegar a una torción completa Agrupación bacteriana de acuerdo con plano en el que puede ocurrir la división celular en una bacteria. Las células hijas se dispondrán junto a la célula madre. Esta disposición es típica en un grupo bacteriano. Por lo que puede usarse para identificar a un grupo de bacterias.  La agrupación bacteriana es una propiedad constante en bacterias que permite identificar fácilmente bacterias en el laboratorio. 1. Pares: se presentan en parejas y dependiente de la forma que poseen se atribuye el nombre. Ej: Diplococo (bacteria Neisseria spp) o diplobacilos 2. Tétradas: se obtienen del resultado de la división de diplococos en el plano perpendicular al primer plano de división. Son 4 bacterias unidas entre si (ej: bacteria Micrococcus spp) 3. Sarcina o cubos: es el resultado cuando un grupo de bacterias agrupadas en forma tétrada ocurre una división en un tercer plano dando origen a un paquete con forma cubica o similar a ello. Esta agrupación es característica del género cocácea. 4. Racimo: la división celular ocurre en tres planos, con una forma irregular. Como resultado se obtienen agrupaciones similares a un racimo de uvas. En este género es característico encontrar a las Staphylococcus 5. Cadena: la división celular ocurre solo en un plano, y las células hijas se disponen al lado de cada célula hija las cuales no se separan después de la división. Formando una cadena de una longitud variable. En este género es característico encontrar a las bacterias Streptococcus, Bacillus y Lactobacillus 6. Empalizada: la agrupación de bacterias solo se da en bacterias con morfología bacilar. Las bacterias se agrupan una al lado de la otra dando la impresión de una empalizada. En este género es característico encontrar a las bacterias Corynebacterium spp. 7. Letra china: la agrupación de bacterias solo se presenta en bacterias con morfología bacilar. Donde las mismas bacterias se disponen formando diferentes ángulos similares a letras chinas...