Exercicios de Cromatografia DE ExclusÃo Molecular PDF

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são exercícios sobre cromatografia parte realizado em laboratório e parte necessitou de cálculos para chegar a resolução ...

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EXERCÍCIOS DE CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR

São José do Rio Preto 2017

INTRODUÇÃO A filtração em gel ou cromatografia de exclusão molecular é o processo de separação das proteínas de acordo com o tamanho. Com este método, as proteínas grandes emergem da coluna mais cedo do que as proteínas menores. A fase sólida consiste em grânulos de polímeros reticulados com poros ou cavidades projetadas com um determinado tamanho. As proteínas grandes não podem entrar nas cavidades e assim, tomam um caminho curto mais rápido através da coluna. Esta cromatografia é utilizada também para estimar o tamanho de uma proteína que está sendo purificada.(Lehninger  et al., 2000) Os resultados obtidos desta separação tamanho-baseada de moléculas permitem que uma curva de calibração seja construída. Isto pode ser usado para calcular o peso molecular de uma molécula desconhecida na amostra permitindo a comparação com proteínas ou polímeros do peso molecular conhecido. (News-Medical.net, 2017) Na dessalinização das proteínas ou de ácidos nucleicos, o limite de exclusão do gel é mantido menor do que o tamanho da molécula do interesse. Assim a molécula do interesse eluted para fora quando as moléculas menores forem apreendidas nos poros do gel. (News-Medical.net, 2017) EXERCÍCIOS A) Faça a curva de calibração da coluna (log m vs. Kav) sabendo que o azul dextran é completamente excluído das microesferas do gel e a Vitamina B12 representa a máxima permeação ou retenção. Calcule o coeficiente de disponibilidade Kav para cada uma das proteínas: Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo) onde Ve é o volume de eluição de cada espécie molecular, Vo o volume de exclusão e Vt o volume da resina: ฀r 2h, onde r é o raio interno da coluna e h a altura da resina, ambos em cm. Faça uma regressão linear e anote os valores obtidos para a equação da reta. ● Para encontrar o valor de Vt: Vt = ฀r2h Vt = ฀ [(1,3 cm) 2] 60 cm Vt = 318,55 cm3 ● Para o cálculo de Kav: 1. Tiroglobulina - Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo) Kav = (119,8 - 112,5)/(318,55-112,5) Kav = 0,035 2. Ferritina - Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo) Kav = (132,9 - 112,5)/(318,55-112,5) Kav = 0,099

3. 4. 5. 6. 7.

Catalase - Kav = 0,22 Gamaglobulina - Kav = 0,22 Aldolase - Kav = 0,24 Ovalbumina - Kav = 0,44 Mioglobina - Kav = 0,61

Tabela 1 - Log m x Kav Proteína

Log m

Kav

Tiroglobulina

2,82

0,035

Ferritina

2,64

0,099

Catalase

2,36

0,22

Gamaglobulina

2,20

0,22

Aldolase

2,20

0,24

Ovalbumina

1,64

0,44

Mioglobina

1,23

0,61

Após obter os valores de Kav e o log m, fora plotado o seguinte gráfico da curva de calibração: Gráfico 1. Curva de calibração a coluna (log m vs. Kav)

Reta: y= -0,355x + 1,03

B) Faça a curva de calibração da coluna (log m vs. Kd) do mesmo experimento. Calcule o coeficiente de distribuição Kd para cada uma das proteínas: Kd= (Ve-Vo)/(Vi) onde Vi é o volume de eluição da espécie química que sofre o máximo de retenção devido à sua pequena massa molecular (corresponde ao volume da fase estacionária). Faça uma regressão linear e anote os valores obtidos para a equação da reta. ● Conhecendo os valores de Vi (volume de retenção) e Vo (volume de exclusão), calculamos Kd da seguinte maneira: 1. Tiroglobulina - Kd= (Ve-Vo)/(Vi) Kd = (119,8 - 112,5)/(239,1) Kd = 0,024 2. Ferritina - Kd= (Ve-Vo)/(Vi) Kd = (132,9 - 112,5)/(239,1) Kd = 0,085

3. Catalase - Kd= (Ve-Vo)/(Vi) Kd = (158,7 - 112,5)/(239,1) Kd = 0,193 4. 5. 6. 7.

Gamaglobulina - Kd = 0,155 Aldolase - Kd = 0,175 Ovalbumina - Kd = 0,312 Mioglobina - Kd = 0,434

Tabela 2 - Log m x Kd Log m

Kd

2,82

0,024

2,64

0,085

2,36

0,193

2,20

0,155

2,20

0,175

1,64

0,312

1,23

0,434

Após obter os valores de Kd e conhecendo o valor de Log m, fora plotado o seguinte gráfico da curva de calibração: Gráfico 2. Curva de calibração a coluna (log m vs. Kd)

Reta: y= -0,2526x + 0,7383 C) Uma proteína “P1” de massa desconhecida eluiu em 171,6 mL. Estime sua massa a partir da curva de calibração usando os gráficos montados em a e b. Utilizando a equação da reta, estima-se a massa de uma proteína P1 Kav = (𝑉𝑒−𝑉𝑜) (𝑉𝑡−𝑉𝑜) → Kav = 0,287 Y = 1,0429 – 0,3583 x 0,287 = 1,0429 – 0,3583 x X = 2,11 = 129,9 kDa Portanto a massa da proteína P1 é de 129,9 kDa. D. Quando o pesquisador tratou a proteína P1 com ditiotreitol (DTT) e bloqueou grupos tiólicos com o agente alquilante iodoacetamida a proteína tratada P1’ eluiu em 200,9 mL. Estime a massa da P1’. O que você deduz sobre P1 e P1’ a partir dos resultados? Para a massa da proteína P1’ Kav = (𝑉𝑒−𝑉𝑜) (𝑉𝑡−𝑉𝑜)

→ Kav = 0,429 Y = 1,0429 – 0,3583 x 0,429 = 1,0429 – 0,3583 x X = 1,71 = 51,6 kDa Portanto a massa da proteína P1’ é de 51,6 kDa. A partir das massas obtidas de P1 e P1’ pode-se concluir que como P1 possui massa maior, suas moléculas são grandes e não penetraram nos poros das microesferas da resina e, assim, saíram mais rapidamente. A massa de P1’ sendo menor evidencia moléculas menores que penetram nos poros da resina, levando mais tempo para atravessar a coluna. E) Uma outra proteína “P2” eluiu somente com 330 mL. O que pode explicar esse Para a massa da proteína P2 Kav = (𝑉𝑒−𝑉𝑜) (𝑉𝑡−𝑉𝑜) → Kav = 1,056 Y = 1,0429 – 0,3583 x 1,056 = 1,0429 – 0,3583 x X = - 0,037 = 0,92 kDa Portanto a massa da proteína P2 é de 0,92 kDa. A partir da massa calculada pode-se concluir que a proteína levou mais tempo que P1 e P1’ para sair devido sua massa muito pequena de 0,92 kDa. Isso pode ser explicado pois suas moléculas ainda menores conseguem passar por mais poros das microesferas de resina, levando mais tempo para atravessar a coluna.

BIBLIOGRAFIA 1. Lehninger, A., Nelson, D., Cox, M., Tilberry, S., Landau, A. and Waites, J. (2000). Principles of biochemistry . New York: Worth. 2. News-Medical.net. (2017). Cromatografia da Exclusão do Tamanho (Filtragem de Gel). [online] Disponível em: Acessado em 12 de novembro de 2017....