Extracción y cuantificación de proteinas PDF

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Summary

En este artículo mostramos el proceso para cuantificar y extraer proteínas utilizando el Método Biuret. El reactivo biuret
es responsable de dar una coloración violeta a las sustancias con presencia de proteínas, después de usar el reactivo es necesario estimar
la absorbancia Es una prop...

Description

Extracción y Cuantificación de proteínas a partir de tejido hepático. Leidy Dayana Murillo Miessler, Johnny Caleb Payan Estupiñan, Alecsandra Janeth Piedrahita Restrepo, Brayan Alexis Quiceno Arenas, Juliana Sierra Martinez Facultad de ciencias exactas y aplicadas, ITM, Medellín, Colombia

Abstract: In this article we show the process to quantifying and extraction of proteins using Biuret Method. The Biuret reagent is responsible for giving a violet coloration to substances with protein presence, After using the reagent it is necessary to estimate the absorbance. It is a property presents in the substances and through this property we can find other quality like the concentration of substances. These methods are important because in the investigation about the tissues contribute information of proteins presents into different body tissues.

I.

INTRODUCCIÓN

La extracción de proteínas a partir de muestras biológicas es un proceso que requiere de ciertos procesos básicos como lo son la homogeneización, la separación de las proteínas (mediante procesos como la ultracentrifugación o precipitación con solventes orgánicos) y la espectrofotometría.

11. Solvente. 12. Solución base. Calibración del espectrofotómetro: Se preparó una solución blanco en una cubeta (celdas cuadradas de 10 mm para espectrofotometría) de 500 µl de agua destilada con 2 ml de reactivo de Biuret. La solución se mezcló y se puso en el espectrofotómetro ya seleccionado con la longitud de onda requerida de 490 nm. Se finalizó activando el espectrofotómetro en transmitancia 100% / Abs 0. Esto permitió que la absorbancia (Abs) de blanco, sea la referente para las demás cuantificaciones.

Para la extracción y cuantificación de las proteínas usamos el espectrómetro lo que dio lugar a un proceso de cuantificación a partir de la lectura de absorción de luz obtenida de y la formación de un complejo coloreado. Dicho complejo fue adquirido gracias al reactivo de Biuret, que detecta la presencia El uso del reactivo de Biuret en la preparación del blanco, en de las proteínas presentes en la muestra y genera una coloración violeta que varía en intensidad según la efecto se debe a la reacción que produce un compuesto coloreado, cuya concentración es proporcional a la concentración proteica. concentración de proteínas [1], permitiendo que la tramitación de 100% se cumpla conforme al índice de Abs de 0. Este proceso permitió comprender de forma clara el proceso de cuantificación de proteínas mediante la técnica colorimétrica Preparación de las cubetas: de Biuret. Se trabajó con 7 cubetas de espectrofotómetro las cuales se les da las siguientes mezclas: II. MATERIALES Y MÉTODOS →Tubo 1: 8 mg/ml de concentración conocida En este laboratorio se hizo uso de: →Tubo 2: 500 µl tubo 1 + 500 µl H2O = 4 mg/ml. 1. Microcentrifugadora. →Tubo 3: 500 µl tubo 2 + 500 µl H2O = 2 mg/ml. 2. Espectrofotómetro. →Tubo 4: 500 µl tubo 1 + 500 µl H2O = 1 mg/ml. 3. Micropipeta. 4. Pipeteador. 5. Tubos de ensayo. 6. Cubetas de espectrofotometría. 7. Hígado licuado. 8. Buffer RIPA. 9. Metanol. 10. Reactivo de biuret.

Imagen 1; cubetas con sus respectivas sustancias, están ordenadas de izquierda a derecha así: blanco, 1 , 2, 3, 4, desconocido e hígado.

→ Cubeta 1: 500 µl del Tubo 1 listo + 2 ml Reactivo de Biuret . → Cubeta 2: 500 µl del Tubo 2 listo + 2 ml Reactivo de Biuret . → Cubeta 3: 500 µl del Tubo 3 listo + 2 ml Reactivo de Biuret . → Cubeta 4: 500 µl del Tubo 4 listo + 2 ml Reactivo de Biuret . → Cubeta “Blanco”: 500 µl H2O + 2 ml Reactivo de Biuret . → Cubeta “Hígado”: Mezcla desconocida y por estudiar . → Cubeta “X”: Mezcla desconocida y por estudiar. Análisis de las cubetas: Se procede a prender el espectrofotómetro para realizar la cuantificación de las proteínas presentes en las cubetas, nos centramos en la capacidad de absorbancia o transmitancia arrojada por el espectrofotómetro según la muestra expuesta en él.

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concentración de la muestra de 25% con respecto al tubo 1. Tubo 4: Con una concentración de 1 mg/ml se obtuvo 0.032, un resultado cercano al factor de concentración esperado de 12.5% con respecto al tubo 1. Tubo 5: Con una concentración desconocida, se obtuvo 0.164. La cuantificación puede que esté alterada y no sean los valores correctos. Tubo 6: Muestra de hígado, con una concentración que debe ser mayor a la muestra concentrada del tubo 1, se obtuvo un resultado de 0,262 por lo que se tuvo un resultado esperado de la cuantificación inicial.

Los resultados esperados y efectivos varían conforme a la aplicación experimental en el laboratorio, es decir, determinado por los pipeteos o por factores de la concentración de la muestra inicial (hígado). Dado a que las unidades de la cuantificación de proteínas es unidimensional, no se muestra en el artículo la unidad específica.

A partir del botón “nm” seleccionaremos una longitud de onda de 490 nm . Insertamos nuestro Blanco para calibrar el espectrofotómetro, gracias a nuestro Blanco podemos dar inicio a la medición de nuestras demas cubetas y analizar sus absorbancias. Análisis de los resultados generales: A partir de los resultados de cada grupo se realizó una tabla con el fin de realizar una comparación gráfica de los resultados obtenidos.

III.

RESULTADOS Los datos obtenidos de las cuantificaciones hechas en el espectrofotómetro; visibles en la columna G2 “tabla 2” fueron: ● Tubo 1: Con una concentración de 8 mg/ml se obtuvo 0,216. ● Tubo 2: Con una concentración de 4 mg/ml se obtuvo 0,080, lo cual indica que no hubo un pipeteo con total exactitud dado a que la concentración en la solución disminuye en un factor de 50% en relación al tubo 1. ● Tubo 3: Con una concentración de 2 mg/ml se obtuvo 0,065, resultado con un índice más cercano al esperado por el factor de

Gráfico 1; Absorbancia VS Concentración, gráfica resultante de los valores ABS promedio de cada grupo.

Como se puede observar en la gráfica 1, presenta una curva de calibración que se representa como una línea recta que sale desde el origen de la gráfica hasta el punto de máxima absorbancia, y por lo tanto las sustancias cumplen con la ley de Lambert-Beer, de la curva se calculó la fórmula de recta usando excel obteniendo así la siguiente fórmula ; y = 0,0225 x 0,0011, e n la cual x es la concentración y la letra y representa la absorbancia. Gracias a esa forma se logró hallar las concentraciones de los tubos desconocido e hígado y de esta forma completar la

tabla 1, presentada a continuación.

V.

BIBLIOGRAFÍA [1] G. C. Karp. Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos. Quinta edición. México: McGraw-Hill Interamericana editores S.A, 2014.

Tabla 1; Absorbancia según su concentración de proteínas en mg/mL. en esta tabla se encuentran los resultados obtenidos de los diferentes grupos que presentaron el laboratorio, además de un promedio ponderado de las absorbancias obtenidas por cada grupo.

IV.

DISCUSIÓN Durante el transcurso del laboratorio pudimos observar que la realización de estos tipos de laboratorios son muy propensos a ocurrir errores por fallas del propio personal que realice la práctica, por ende se debe tener mucho cuidado al realizar cada paso de la práctica, otra posible falla que logramos ver durante la práctica fue en la preparación del blanco, el cual es muy importante para calibrar el espectrofotómetro, ya que con este se van a tomar todas las medidas por lo tanto se recomienda tener las precauciones necesarias para obtener un blanco deseado a la hora de calibrar el espectrofotómetro. Gracias a la espectrometría para la cuantificación de proteínas se logró encontrar la concentración de los tubos con la sustancia desconocida e hígado, por medio de la curva de calibración y la ecuación de su pendiente.

V.

CONCLUSIÓN Efectivamente, aplicando el método Biuret se puede determinar la concentración de proteína en una o varias muestras problema, que resultan al interpolar los valores de absorbancia en una curva patrón originada a partir de concentración de proteína conocida. El resultado dependerá de forma directa del correcto manejo de los reactivos y sustancias dadas ya que el mal manejo de estos puede ocasionar una mala relación de la absorbancia en las muestras....