Fermentación alcohólica de diferentes sustratos PDF

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Reporte de Laboratorio de Bioquímica General. 18-10-2016 Fermentación alcohólica de diferentes sustratos.

Introducción. La fermentación alcohólica, denominada también como fermentación del etanol o incluso fermentación etílica, es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxigeno - O 2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya fórmula química es: CH 3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. (SA, 2007). Saccharomyces cerevisiae, es una levadura que se utiliza desde hace más de 250 años para la producción de cerveza, vino y pan. Esta levadura es capaz de sobrevivir siguiendo dos rutas metabólicas: una de ellas es la fermentación en la que la levadura está fuera de contacto con el oxígeno, obteniendo la energía necesaria para llevar a cabo sus procesos vitales a partir de metabolizar carbohidratos, produciendo etanol y CO 2. Esta levadura, requiere que la glucosa sea catabolizada mediante la glucólisis o ruta de Embden-Meyerhof, para obtener el piruvato el cual posteriormente por la acción de enzimas específicas, se convierte anaeróbicamente en etanol y CO 2 (González, M. Hernández, F. Perea, M. 2016). Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Entre los azúcares que puede utilizar están monosacáridos como la glucosa, fructosa manosa y galactosa entre otros. También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la sacarosa y trisacáridos como la rafinosa. Los glúcidos, carbohidratos, hidratos de carbono o sacáridos son moléculas orgánicas compuestas por carbono, hidrógeno y oxígeno. Son solubles en agua y se clasifican de acuerdo a la cantidad de carbonos o por el grupo funcional aldehído. Son la forma biológica primaria de almacenamiento y consumo de energía. (Cruz, M. Hurtado, G. Macías, B. 2012). El ensayo de Fehling pone de manifiesto la presencia de azucares reductores (aldosas: glucosa, ribosa, eritrosa, etc.). Se trata de una reacción redox en la que el grupo aldehído (reductor) de los azúcares es oxidado a grupo ácido por el Cu2+ que se reduce a Cu+ . Tanto los monosacáridos como los disacáridos reductores reaccionan con el Cu 2+ dando un precipitado rojo de óxido cuproso. La

reacción tiene lugar en medio básico por lo que es necesario introducir en la reacción tartrato sódicopotásico para evitar la precipitación del hidróxido cúprico. La prueba de Fehling no es específica; otras sustancias que dan reacción positiva son los fenoles, aminofenoles, benzoína, ácido úrico, catecol, ácido fórmico, hidrazobenceno, fenilhidrazina, pirogalol y Resorcinol (Rodríguez, A. 2005). El objetivo de esta práctica es inducir la formación de etanol mediante la fermentación anaeróbica de diferentes hidratos de carbono con levaduras Saccharomyces cerevisiae. Método. Se preparó 25 ml de una solución de sustrato (glucosa y sucralosa) al 5%. Se separó 3 ml en un tubo de ensayo y al resto se le agrego para el caso de glucosa 0.5 g de levadura Saccharomyces cerevisiae y para sucralosa 1 g de levadura. Se introdujo cada muestra en un sacarímetro de Einhorn. Después de mantuvo a una temperatura de 40°C y en observación por 40 min anotando cada 10 min la cantidad de CO 2 formada en cm. Una vez transcurrido el tiempo se realizó la prueba de Fehling para azucares reductores y la prueba para etanol. Para la prueba de Fehling se utilizaron 3 ml de sustancia del sacarímetro, los 3 ml de sustrato que quedaron reservados en un tubo de ensayo y 3 ml de agua destilada de control. Se incorporó 1 ml de reactivo de Fehling A y 1 ml de reactivo de Fehling B, se agitó y se calentó a baño maría durante 5 min. Para la prueba para etanol se colocó 2 ml de muestra del sacarímetro en un tubo de ensayo y se agregó 0.5 g de dicromato de potasio y 2 ml de ácido sulfúrico. Se calentó a baño maría por 5 min y se observó los colores formados. Resultados y discusión. La glucosa como sustrato resulto ser muy efectiva, ya que se pudo observar un notorio aumento en el volumen de CO2 durante el transcurso del experimento (Figura 1), resultando en aproximadamente una velocidad de 0.316 ml de CO2/min.

Volumen de CO2 (ml)

misma cantidad de CO2 debido a que se encuentran en su estado de equilibrio.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

En cuanto a la prueba de Fehling los resultados se muestran en la tabla 1: Tabla 1: Resultados para prueba de Fehling para glucosa.

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20

30

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Tiempo (min)

Glucosa Muestra del sacarímetro Control

+ + -

Figura 1: Grafica del volumen de CO2 producido con glucosa como sustrato con respecto al tiempo.

El rendimiento teórico estequiométrico para la transformación de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1g de glucosa. C6H12O6 2C2H5OH 2CO2 En la realidad es difícil lograr este rendimiento, porque, la levadura utiliza la glucosa para la producción de otros metabolitos. El rendimiento experimental varía entre 90% y 95% del teórico, es decir, de 0.469 a 0.485 g/g. (Vázquez, H. Dacosta, O. 2007). Comparando la gráfica obtenida con otra de un estudio realizado por González, M. Hernández, F. Perea, M. (2016), donde se utilizó también glucosa como sustrato, que se tiene un comportamiento muy similar a la obtenida en esta práctica, por lo que se puede asegurar que se realizó una buena medición. (Figura 2)

Figura 3: Imagen de prueba de Fehling para glucosa, de izquierda a derecha: Glucosa, muestra del sacarímetro y control.

Esto nos indica que la glucosa en un inicio si había azúcar reductor, también que aún se encontraba azúcar reductor una vez transcurrido el tiempo de fermentación aun contenía glucosa y en el control de agua no se encontraba ninguno, por lo que la reacción pudo llevarse a cabo sin complicación. Y para la prueba para etanol se obtuvo un resultado +, por lo cual se pudo comprobar que en la fermentación de glucosa si se produce etanol.

Figura 2: Grafica del volumen de CO2 producido con glucosa como sustrato con respecto al tiempo, se observan los registros experimentales y su promedio realizada por González, M. Hernández, F. Perea, M. (2016).

En las 2 graficas se puede observar cómo se llega a un punto máximo donde el volumen ya no crece, esto se debe a 2 razones, la primera es que se alcanzó el volumen máximo de medición por el recipiente, y la otra es que las levaduras ya no están produciendo la

Volumen de CO2 (ml)

En cuanto a la sucralosa, se puede observar en la figura 4 el volumen de CO2 generado por la fermentación de sucralosa con respecto al tiempo, donde se obtiene una velocidad de 0.087 ml de CO2/min. 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

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Tiempo (min)

Figura 4: Grafica del volumen de CO2 producido con Sucralosa como sustrato con respecto al tiempo.

El que no se tenga una velocidad de fermentación rápida con ese sustrato se debe a que la molécula de sucralosa se obtiene a partir de la cloración de una molécula de sacarosa, en la cual se sustituyen tres grupos hidroxilo por iones cloruro haciendo que esta no contenga glucosa y no pueda ser aprovechada por la levadura. Además, no puede ser absorbida fácilmente por el tubo digestivo, 85% de la sucralosa ingerida es eliminada con las heces y el restante 15% que se absorbe de manera pasiva no puede ser metabolizado con fines energéticos; al ser altamente soluble en agua y no ligarse a las proteínas plasmáticas es eliminada por vía renal sin decloración en las 24 horas posteriores a su consumo sin efecto osmótico alguno (González, A. 2013).

Conclusiones. La fermentación es un proceso anaeróbico realizado por levaduras, las cuales a partir de un sustrato producen CO 2, ATP y etanol, siempre y cuando el sustrato contenga glucosa. Un ejemplo es la glucosa pura, que es una de más maneras donde se obtiene más volumen de CO 2 y metanol, en cambio la sucralosa carece de glucosa y no produce en si la fermentación, se tienen muy pequeñas cantidades de volumen de CO2.Es impórtate estar conscientes de estos procesos para poder aplicarlos en la vida diaria al momento de cocinar y de querer llevar a cabo un proceso biotecnológico. Se queda concluido que se cumplió con el objetivo de la práctica.

Los resultados de la prueba de Fehling para sucralosa se encuentran en la tabla 2:

Cruz, M. Hurtado, G. Macías, B. (2012). Rapidez de fermentación por Saccharomyces cerevisiae de algunos tipos de glúcidos. XXIII CONGRESO DE INVESTIGACIÓN CUAM – ACMor. Colegio Juan Jacobo Rousseau. Pág. 3

Tabla 2: Resultados para prueba de Fehling para

Sucralosa Muestra del sacarímetro Control

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Referencias.

González, A. (2013). Posición de consenso sobre las bebidas con edulcorantes no calóricos y su relación con la salud. En: Revista mexicana de cardiología. Volumen 24, Número 2. Pag 55,68. González, M. Hernández, F. Perea, M. (2016). Efecto del sustrato en la liberación de CO2 por S. Cerevisiae. XXI Concurso Universitario de Ciencias, Tecnología e Innovación de la UNAM. Pág. 4

Figura 5: Resultados de prueba de Fehling para sucralosa.

Esto nos indica que la sucralosa en un inicio si había azúcar reductor, aunque de baja capacidad, también que aún se encontraba azúcar reductor una vez transcurrido el tiempo de fermentación aun contenía sucralosa, pero esta vez menos, y en el control de agua no se encontraba ninguno, por lo que la reacción pudo llevarse a cabo sin complicación. Y para la prueba para etanol se obtuvo un resultado +, esto puede ser indicativo a que la levadura fermento otro tipo de azúcar que se encontraba por ahí o que la sucralosa contenía muy poca capacidad para llegar a la fase de la producción de etanol.

Rodríguez, A. (2005). Reaccionó de Fehling. En: Identificación y cuantificación de azucares. Facultad de biología. Departamento de bioquímica y biología molecular. Universidad de la Laguna. Islas Canarias. Recuperado de: https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/5.p df SA. (2007). Capitulo II. Fermentación alcohólica. Recuperado de: http://www.unac.edu.pe/documentos/organizaci on/vri/cdcitra/Informes_Finales_Investigacion/ Octubre_2011/IF_DECHECO %20EGUSQUIZA_FIPA/CAPITULO%20N %BA%2002.pdf Vázquez, H. Dacosta, O. (2007). Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía renovable a partir de desechos

agrícolas. Revista ingeniería, Investigación y Tecnología. Vol. VIII. 249-259...