GEN502 CM 3 - Opéron Lactose M. Courageot PDF

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sciences pour la santé , biologie santé , 3em année de biologie...

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GEN502 – CM 3

Génétique Procaryotes & Moléculaires

Opéron Lactose

L’opéron lactose I. Ada Adapta pta ptation tion eenz nz nzyma yma ymatiqu tiqu tique e de E. col colii Ces études ont démarré à partir des travaux de Monod qui a étudié le développement de bactéries en présence de lactose F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff ont reçu un Prix Nobel en 1965. E. coli est capable d’utilisé le lactose si le glucose est absent du milieu. Ils ont montré une période d’adaptation d’E. coli.

A. Pé Périod riod riode e d’ d’adap adap adapta ta tation tion et β β-gal -gal -galact act actosid osid osidase ase Mise en évidence d’une période d’adaptation de la bactérie. Certaines bactéries sont capables de s’adapter à leur milieu, elles sont capables d’utiliser d’autres substances nécessaires à leur croissance après une certaine période. Le lactose est un disaccharide qui doit être clivé en deux sucres plus simples (galactose et glucose) avant de pouvoir être utilisé.

Le plateau représente la période d’adaptation. L’enzyme utilisé est la β-galactosidase. On va essayer de savoir si dans la régulation des gènes, tous les gènes sont tout le temps transcrit ou s’il existe un mécanisme de régulation des gènes utilisation dans un premier temps du glucose puis changement du métabolisme pour pouvoir utiliser un autre sucre comme le lactose ou le galactose

B. Tran Transfor sfor sforma ma mation tion ou ssynth ynth ynthès ès èse e de nov novo o de la β-ga -galac lac lactosid tosid tosidase ase Pour la mise en évidence de la transformation ou de la synthèse, on utiliser des techniques de radioactivité. La β-galactosidase est une enzyme soluble facilement dosable par des molécules colorimétriques.  On va cultiver les bactéries sur un milieu minimum contenant du glucose marqué au 35S. On trouve des protéines marquées au 35S, mais il n’y a pas de β-galactosidase On va cultiver les bactéries sur un milieu minimum contenant du lactose marqué au 32S. On trouve des protéines marquées au 35S et de la β-galactosidase marquée au 32S La β-galactosidase n’est pas radiomarquée → elle est donc néosynthétisée

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 On refait la même expérience, mais en marquant le lactose avec du 35S et en marquant le glucos e avec du 32S Dans le cas du lactose, on retrouve des protéines 35 S et de la β-galactosidase marquées au 35S Dans le cas du glucose, on retrouve des protéines 35 S et de la β-galactosidase marquées au 35S. Cependant, la quantité des protéines à diminuer (la quantité de la β-galactosidase est identique). Sans lactose, la synthèse de la β-galactosidase est stoppée  Adaptation La synthèse de β-galactosidase a lieu s’il y a la présence de lactose sans glucose dans le milieu. → Il existe donc un mécanisme d’adaptation permettant à la cellule de déclencher ou d’arrêter le fonctionnement du gène, c’est-à-dire son expression sous forme de protéine, en réponse à des signaux de l’environnement. Quel est ce mécanisme ?

C.

enz enzyme yme / st structu ructu ructure re m mol ol olécul écul éculaire aire de l’l’in in induct duct ducteur eur

:r

Induction par d’autres galactosides (sans glucose) ? Relation structure moléculaire de l’inducteur et la formation de l’enzyme nouvellement synthétisée. IPTG

on inducteur de l’enzyme et n’est pas un substrat de la β-galactosidase.

Il n’y a pas de relation directe entre l’induction et la synthèse de l’enzyme. Le lactose ne permet pas de synthétiser la β-galactosidase mais aide à induire cette synthèse.

I. Lactose : substrat de l'enzyme, faible activité inductrice. II. Méthyl-ß-D-galactoside : substrat de faible affinité, inducteur efficace. III. Méthyl-ß-D-thiogalactoside : non hydrolysable par l'enzyme, mais puissant inducteur. IV. Phényl-ß-galactoside : excellent substrat de l’enzyme, haute affinité, faible activité inductrice. V. Phényl-ß-D-thiogalactoside : pas d'activité comme substrat ni comme inducteur, mais doué d'activité comme antagoniste des inducteurs

D. Gène Gèness ccontr ontr ontrôlés ôlés de m man an anièr ièr ières es D’autres enzymes sont synthétisées en présence de lactose ? • • •

β-galactosidase : (z) β-galactosidase perméase : (y) → sert à rendre la bactérie perméable pour faire entrer du lactose afin d’induire la production d’enzymes Thiogalactosidase transacétylase : (a)

→ La synthèse de novo de ces trois enzymes est coordonnée en présence de lactose comme seule source de carbone

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 Messager polycistronique Fixation d’une ARN polymérase sur son transmetteur → produit les trois enzymes après la transcription

II. L’o L’opéro péro péron n lac lactose tose A. Ces mutants ont perdu la faculté de synthétiser une de ces trois enzymes par mutants [lac-] comme : • β-galactosidase- : • β-galactosidase perméase - : • Thiogalactosidase transacétylase - :

→ ce sont des

B. Déc Découve ouve ouverte rte de mu mutan tan tants ts « cons construc truc tructifs tifs » Ces mutants ont subi une p erte de la faculté d’adaptation enzymatique et la synthèse de la β-galactosidase en grande quantité Les [lac]+ constitutifs ont une synthèse continue des trois enzymes en absence d’inducteur t responsable de l’inductibilité (ne code pas pour l’inducteur qui est le sucre → répond favorablement à un inducteur sauf s’il est muté) : Responsable de l’inductibilité • [Lac+] constitutifs = i• [Lac+] sauvage = i+ C’est un gène de régulation différent des gènes de structures (z, y, a). La régulation exprime son rôle via la synthèse d’une protéine régulant la synthèse des gènes.

C. Car Cartogr togr tographi aphi aphie e de l’op l’opér ér éron on lac lactose tose Il y a trois gènes structuraux (z, y et a) qui : • • • Il y a la présence d’un promoteur qui contient un site CRP et qui contient un opérateur. Système IPOZYA

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D. Mod Mode ed de e rég régula ula ulation tion du gèn gène ei  Hypothèse n°1 Les souches constitutives ont le gène i-. induites → c’est la théorie de l’induction géné

, elles sont donc toujours

 Hypothèse n°2 Les souches i+ inductibles synthétisant un inhibiteur de la synthèse des trois enzymes. L’inducteur en inactivant cet inhibiteur, permet la synthèse de ces trois enzymes. → c’est la théorie de la Si on a un i-, on a un répresseur muté.  Dans un milieu sans lactose, une fois que les mérozygotes sont formés, on observe la synthèse de β-galactosidase active Après 30 minutes, il y a arrêt de la synthèse qui devient inductible → Donc synthèse de β-galactosidase uniquement en présence de lactose Il semble que i+ est dominant sur i- mais il faut du temps . Le rôle de répresseur domine sur celui de l’inducteur.

E. Réalisation d’un croisement Hfr (λ) lysogène * F- non lysogène Dès le début du transfert lambda, il y a induction, multiplication des phages et lyse des mérozygotes. Alors que les gènes sont inactifs chez Hfr mais s’expriment toute de suite chez FUn produit empêche z de fonctionner dans le cytoplasme de Hfr → z+ est inactif Ce produit est absent du cytoplasme de F- → les gènes s’expriment On aurait donc une répression synthétisée par i+ mais non par i-. Donc plutôt une répression généralisée et non une induction généralisée.  Vérification Pour verifier que i+ est dominant sur iHfr i- z- * F- i+ z+ Dans un milieu sans lactose, une fois que les mérozygotes sont formés, on n’observe jamais la production de βgalactosidase active Après le croisement, la composition en gènes est identique que le croisement précédant, la seule différence étant le cytoplasme. Ici le cytoplasme de F- contient déjà le répresseur donc il n’y a pas de possibilité d’expression de z + Conclusion : il n’y a pas d’inducteur synthétisé par i

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F. Mécan écanism ism isme ed de e ré répress press pression ion L’hypothèse de Jacob dit que le mécanisme de la répression se fait directement sur l’ADN pour permettre ou non la synthèse coordonnée des trois protéines du système lactose. On synthétise un répresseur qui permet la répression des gènes qui code pour le lactose. L’hypothèse de Monod dit que le possède deux sites actifs : • Un qui se lie à l’ADN et dont la modification correspond à • Un qui doit se lier à l’inducteur Lorsque l’inducteur se lie au répresseur, il y a une modification stéréospécifique qui détache le répresseur de l’ADN. 

Avec le mutant iS, on recherche un mutant non inductible et avec jamais de synthèse des enzymes. Il faut prendre un phénotype [lac-] dominant sur i+ et non inductible. On met en évidence que l’hypothèse de Monod est la bonne.

F- lac+ (i+ z+ y+ a+) et un grand nombre de Hfr lacSi après la conjugaison, [lac-] alors il y a dominance sur i+ et une autre mutation que z, y, a Cartographie : mutation dans i : super répresseur iS et mise en évidence de l’interaction inducteur / répresseur  Le répresseur C’est un tétramère contenant trois domaines : • Domaine de fixation à l’ADN • Domaine de fixation de l’inducteur • Domaine d’

G. L’op L’opéra éra érateur teur On recherche d’une mutation qui empêche la liaison répresseur / « interrupteur » au niveau de l’interrupte ur = opérateur Ces mutants doivent être : • Constitutifs puisqu’ils empêchent la liaison du répresseur • Se trouver en dehors du gène i • Être dominant sur i+ • Être dominants sur o+ en cis (gènes adjacents) → la mutation n’aura de répercutions que sur la séquence en cis Utilisation de mérozygotes stables i+ z+ / F’ i+ z+ [lac+ inductible] et recherches de mutants [lac+] constitutifs : • Soit double mutation i- (improbable 2*10-5) • Soit d’une mutation de l’opérateur : Oc

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1. Au début de z, il y a un effet sur z s’il lui est adjacent → cis-dominance La mutation Oc est dominante sur la mutation iS en Cis

i+ o + z+ i+ oc z+ + i i+ o + zi+ o + z+ i+ o c zi+ o + zi+ o c z+ is o + z+ i+ o c z+

Présence de la β-galactosidase Active Inactive -Inducteur + inducteur -inducteur +inducteur + + +

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

2. Mu Mutant tant Oc ssans ans lac lactose tose Le répresseur est normal actif mais ne peut se fixer sur l’opérateur. Il y a une production de β-gal même en absence de lactose. Le promoteur fixe l’ARN polymérase pour permettre la transcription du messager polycistronique.

3. Lac I – le sit site e de liais liaison on d du u rrépres épres épresseu seu seurr à l’AD l’ADN N se situ situe e dan danss l’l’op op opérat érat érateur eur llac ac C’est une séquence répétée inversée comme pour beaucoup de p rotéines régulatrices se fixant à l’ADN.

Il existe 3 séquences opératrices de l’opéron lac : • O1 au niveau du promoteur (11 pb après) • O2 au niveau de LacZ • O3 en avant du promoteur (82 pb avant le promoteur) Il peut se former une boucle entre O3 et O1, ce qui piège le promoteur.

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Quand les trois opérateurs sont à l’état sauvage, on a un score de 1 300 de répression par un i+. Quand on mute la séquence O2 situé dans LacZ, on va perdre complétement la répression par le répresseur, le score de répression est de 440. Les trois séquences sont essentielles.

LacI forme un obstacle stérique empêchant l’ARN polymérase d’avancer. On a environ 40 molécules de LacI par cellule = 10 tétramères

H. «

»=m mut ut utation ation du site P

Oc contrôle les trois cistrons car

z+ y+ a+ / F’ O z+ y+ a+ sont constitutifs pour les 3 enzymes.

S’il y a un contrôle de l’expression de z, y et a, on devrait pouvoir trouver des mutants ayant perdu leurs trois fonctions en une fois • Une mutation Oo entraine le phénotype [lac-] pour les trois enzymes. Il y a donc un seul opérateur contrôle qui l’expression coordonnée d’une séquence de gènes. L’opérateur et le •

Le gène opérateur de structure qu’il contrôle représente une → c’est l’ . l’ARN polymérase

I. Ces mutations touchent les gènes de structure z, y et a

1. Mu Mutati tati tations ons p pola ola olaires ires Les mutations polaires ont lieu au niveau des gènes de structure. Elles touchent les gènes où elles sont localisées mais aussi l’expression des gènes

Il peut y avoir : • Une mutation avec un arrêt de lecture → présence d’un codon non-sens dans z : pas de y, pas de a. • Un codon stop.

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2. Mu Mutati tati tations ons ffaux aux sens Par exemple, une mutation faux sens de z donne l’incorporation d’un mauvais acide aminé dans la βgalactosidase, mais la traduction est normale pour les deux autres ARNm : y et a. S’il y a une mutation faux-sens de z, il n’y aura pas d’impact sur la transacétylase.

J. Car Caracté acté actérisa risa risation tion de l’l’opéro opéro opéron n lac lactose tose (1 (1966 966 : Walter Gilb Gilbert) ert) Le répresseur est un tétramètre comportant des SU de 38 kDa (ne fait pas partie de l’opéron). Il est possible de faire un isolement et d’étudier l’opérateur 25 pb (structure palindromique 21 pb) Opérateur + promoteur = 82 pb L’opéron regroupe des gènes de structure à synthèse coordonnée donnant lieu à un messager polycistronique en Cis et les gènes contrôlant la transcription : c’est un promoteur + un opérateur Nom = n’intervient Les régulons sont composés d’un même gène régulateur qui contrôle l’expression de plusieurs opéron (exemple :

K.

–

Il y a un effet inducteur du lactose s’il n’y a pas de glucose dans le milieu. Dès que le glucose se trouve dans le milieu, les autres sucres ne peuvent pas être utilisés. La répression se fait par : • L’utilisation préférentielle du glucose • Un mécanisme de répression catabolique

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On fait un test sur un mixte glucose / lactose et on observe la croissance des bactéries. Quel que soit la concentration des deux sucres glucose, les bactériens ne se trompent pas. Quand on a 1/3, on utilise rapidement le glucose, après on utilise le lactose. Le glucose est toujours utilisé avant le lactose. Les bactéries sont capables d’inhiber l’utilisation du lactose au profit du glucose.

Le modèle n’explique pas le

classique

Schéma : boule verte = lactose

L’AMPc semble capable de réguler l’activité de la β-gal. Quand il n’y a pas d’AMPc, l’activité β-gal est moins importante. Schéma : Courbe points foncés = avec AMPc Courbe points clairs = sans AMPc

L’adénylate cyclase catalyse la synthèse de l’AMPc à partir de l’ATP.

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La répression catabolique semble s’expliquer par la variation de la concentration d’AMPc : • L’ . Reste à trouver sa cible • En présence du glucose, la synthèse de l’AMPc est inhibée • En l’absence de glucose, la concentration de l’AMPc augmente fortement

La

cible

d’action de l’AMPC est un activateur c’est CAP – protéine activatrice des catabolites (ou On observe une modification de la structure protéique et la fixation de CAP – AMPc va permettre de recruter l’ARN polymérase.

La CRP a deux conformations possibles : • L’une incapable de se lier à l’ADN sans son effecteur AMPc → situation rencontrée en présence du glucose • L’une se fixe à l’ADN en présence d’AMPc → situation qui se réalise en l’absence de glucose

Le site de fixation de CAP est présent dans la région promotrice de l’opéron lac. Pour le mettre en évidence, on utilise une méthode de digestion. La régulation de l’opéron lac est double → il y a activation par CRP et répression par LacI

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e

Opéron lactose : système inductible à contrôle négatif (I) qui nécessite d’avoir un complexe CAP / AMPc pour être activé après l’inhibition de I. • En présence du lactose, et en l’absence de glucose → CAP + AMPc active la transcription de l’opéron lac • S’il n’y a pas de glucose, ni de lactose → CAP + AMPc sont fixés sur le promoteur et le répresseur est fixé sur l’opérateur → il n’y a pas de transcription (système réprimé) • En présence de glucose et de lactose, il va y avoir peu d’ARNm produit • En absence de glucose et en présence de lactose, il y a beaucoup d’ARNm produit

Il y a le paradoxe d’une régulation parfaite Lac est faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur Pourquoi une régulation parfaite serait-elle une erreur biologique ? •

•

Avec la fuite o Après une longue absence, le lactose est ajouté dans le milieu o Les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et Lac Z pour transporter le lactose et produire l’inducteur o L’induction du système est donc possible, l’opéron lac s’exprime et le lactose est massivement transporté et consommé Sans fuite o Après une longue absence le lactose est ajouté dans le milieu o Aucune molécule LacY n’est présente dans la bactérie o Le lactose ne rentre pas et l’opéron lac n’est pas induit o Pire encore, l’opéron lac ne peut jamais être induit o E. coli meurt de faim en baignant dans le lactose

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III. Sys Système tème tèmess de ré régula gula gulation tion

le con contrôle trôle pos positif itif et nég négatif atif → ex exempl empl emple e de l’opé l’opéro ro ron n ar arabin abin abinose ose

A.

La même molécule joue un rôle d’activateur et de répresseur. AraC joue un rôle d’activateur et de répresseur avec un changement d’état. Quand on a i- chez l’opéron lactose, on aura une [lac+] constitutif mais avec l’arabinose, on aura un [ara-] Il y a un double contrôle par la même protéine • Contrôle négatif gène i (répresseur) qui se fixe sur l’opérateur : il n’y a pas d’expression ni de transcription • Contrôle positif avec un complexe inducteur / répresseur et une libération du site opérateur. Mais nécessité que la fixation du complexe I/R se fasse sur le site initiateur pour démarrer la transcription

B. Sys Système tème rép répres res ressibl sibl sible e à ccontr ontr ontrôle ôle nég négatif atif mul multivale tivale tivalent nt ou C’est la même chose que pour l’opéron tryptophane (système répressible à contrôle négatif), mais ce n’est pas le produit final qui va permettre l’inhibition de la transcription, mais plusieurs intermédiaires qui sont nécessaires pour que le répresseur soit actif Les intermédiaires sont des protéines issues de l’opéron Il peut y avoir des • •

: ça peut être l’un ou l’autre des produits quand deux produits doivent être fixés sur l’opérateur pour fixer le répresseur

C. Un des produits de cet opéron (enzyme), quand il est lié au substrat, il y a fixation sur l’opérateur et arrêt de la transcription Ici, il n’y a pas de gène régulateur

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