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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BUCARAMANGA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD- PROGRAMA MEDICINA GUIA LABORATORIO ESPECTROFOTOMETRIA COMPETENCIAS 1. Conocer los fundamentos de los fenómenos de transmisión y absorción de luz y las leyes que los rigen. 2. Comprender los principios básicos de espectrofotometría de absorción 3. Construir una curva de calibración, y a partir de ella saber calcular la concentración de una sustancia. 4. Construir el espectro de absorción de una solución coloreada 5. Analizar el espectro de absorción del NADH en el rango ultravioleta ESPECTROFOTOMETRIA Naturaleza de la Radiación electromagnética La luz es una forma de energía radiante o electromagnética. Otras formas de energía electromagnética son las ondas de radio, los rayos infrarrojos, los rayos X y los ultravioleta. Las radiaciones electromagnéticas se consideran movimiento de campos eléctricos y magnéticos que oscilan en forma de ondas, en planos perpendiculares. Una fuente de luz genera un haz de ondas electromagnéticas que se desplazan en el espacio. Como todo movimiento ondulatorio, las radiaciones electromagnéticas se caracterizan por tener una longitud de onda y una frecuencia. Longitud de Onda (λ) lamda: Se define como la distancia mínima entre dos máximos de un ciclo del movimiento ondulatorio. Esta distancia se expresa, según el sistema Internacional de unidades (SI), en nanómetros (nm, 10―9 m).

Frecuencia: (n): El número de veces que esta longitud de onda pasa por un punto x en un segundo, se conoce con el nombre de frecuencia.

La luz no necesita un medio para transportarse, se propaga en el espacio vacío a la velocidad de 300.000 km/ seg y se representa por el símbolo C. C: velocidad de la luz. La longitud de onda, la frecuencia y la velocidad de la luz, están relacionadas mediante la siguiente ecuación: C= λ X ν En 1900, Max Planck, físico alemán, experimentó y analizó las radiaciones emitidas por sólidos sometidos a diversas temperaturas. Descubrió, con base en estos experimentos, que los átomos y las moléculas emiten energía en forma de paquetes o cuantos. También indicó que la cantidad de energía liberada está relacionada directamente con la frecuencia de la luz emitida. La energía para un cuanto de energía (luz) o fotòn dado se puede calcular directamente de la ecuación de Planck: E= hn, Donde E=energía, h= constante de Planck (6.62 x 10 -27 ergios/seg) y n es frecuencia. Si la frecuencia = C/ λ , se puede reemplazar, así: E = h C/ λ Cómo se puede observar, la relación entre la longitud de onda y la energía de una radiación electromagnética es inversa, de manera que cuanto mayor es la longitud de onda de un haz de luz, menor es su energía. El ordenamiento de las radiaciones electromagnéticas, según la longitud de onda, se conoce con el nombre de espectro electromagnético. Este espectro electromagnético cubre un amplio intervalo de energía radiante, incluyendo desde los rayos gamma, de longitud de onda corta, hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. El espectro electromagnético se divide en regiones, que abarcan intervalos de longitudes más estrechas.

El ojo humano responde a la radiación electromagnética entre los 380 y 750 nm aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra limitación, y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y menores ultravioleta (UV).

La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones de distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como “blanca”. En la región visible, la luz se descompone en colores y sus colores complementarios. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y sólo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidos. Cuando se produce una interacción entre un haz de luz y la materia, se producen, entre otros, fenómenos de absorción o emisión de energía. Cuando una partícula, que se encuentra en estado de reposo o en estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe energía, y pasa a lo que se denomina estado excitado. En la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia partícula (tipos de enlaces) y de la energía (longitud de onda) de la luz que interacciona. Cuando la luz solar o la luz producida por una bombilla de tungsteno se hacen pasar a través de un prisma de difracción, se produce una gama de colores como espectro de absorción. Algunos compuestos tienen la propiedad, tras ser excitados, de retornar a su estado fundamental o de reposo, produciendo una emisión de energía radiante. La luz emitida se puede medir, y ello constituye el principio de algunas técnicas, como la Fotometría de llama, o la Fluorescencia. Pero en este momento nos centraremos sólo en la Espectrofotometría de absorción: Espectro de absorción: Cada especie absorbente (cromógeno) tiene lo que se llama espectro de absorción característico. Este espectro representa la relación entre la longitud de onda incidente y la absorbancia que presenta una solución de la especie, en condiciones de finidas de trabajo. Al gráfico que resulta de representar en un eje de coordenadas Absorbancia (ordenadas o eje Y) frente a la longitud de onda (abscisas o eje X), es a lo que llamamos, espectro de absorción. Una buena proporción de la metodología utilizada para cuantificar sustancias que se encuentran normal o anormalmente en los tejidos y diferentes líquidos biológicos (sangre, orina, líquido cefalorraquídeo LCR, contenido gástrico etc.). Se basa en producir soluciones coloreadas en las cuales la INTENSIDAD DEL COLOR puede tomarse como medida directa de la concentración de la sustancia. Otras sustancias que son incoloras para el ojo humano, también tienen la particularidad de absorber luz a longitudes de onda inferiores a 400 nm o superiores a 700 nm. El equipo utilizado para desarrollar esta metodología es el ESPECTROFOTÓMETRO, el que: nos permite medir la intensidad de la luz transmitida y consta de:

* Una fuente luminosa que emite radiaciones de luz blanca que pasa a través de un dispositivo de monocromía: cuya función es descomponer el rayo de luz blanca en todos sus componentes. * La abertura de una rejilla que nos permite seleccionar cuidadosamente un rayo de luz que corresponde a una determinada longitud de onda según los requerimientos. EL ESPECTROFOTMETRO está constituido por una célula fotoeléctrica sensible a la gama de longitudes de onda de luz emitida y un galvanómetro que registra los potenciales originados por la célula fotoeléctrica; estos potenciales son transcritos a una escala de transmitancia (%T) o de absorbancia (A). PARA RECORDAR: Las diferentes sustancias en solución exhiben determinados colores porque al pasar a través de ellas la luz blanca absorben y transmiten algunas longitudes de onda. Esta es una propiedad que depende de la naturaleza de la sustancia.

Fig. 1: Espectrofotómetro de uso común en el laboratorio

ESPECTROFOTOMETRO. SPECTRONIC 20+, MILTON ROY LEYES DE LA ABSORCION: Cuando un haz de luz de intensidad I° incide sobre una cubeta cuadrada que contiene una solución coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se produce

en la solución un proceso de absorción, y el haz de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene una intensidad menor (I). Se define como TRANSMITANCIA la relación entre la luz incidente y la luz transmitida o emergente: T= I/Io

En la práctica se define el porcentaje de transmitancia: %T = I/Io X 100 En la práctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de Absorbancia, ya que la relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica, mientras que la relación entre la absorbancia y concentración es directamente proporcional: A= -Log I/I° = -log T = Log 1/T

A= 2 – Log %T A=Log 100 /%T = log 100 – Log T De esta relación matemática se deduce que la relación logarítmica entre A y %T se traduce en dos escalas: %T: Va desde 0 a 100; Si %T = 100, entonces: A = 2 – Log100=0 A: va de µ a 0.... Si %T = 0, entonces: A = 2 –Log 0 = µ Si representamos gráficamente en un eje de coordenadas la relación entre la absorbancia y concentración, obtenemos una línea recta, y la proporción es directa; La grafica resultante de representar %T frente a una concentración es una curva. La relación entre las cantidades de absorbente en una solución y el grado en que esta solución absorbe luz, se encuentra regida por las Leyes de Absorción. La LEY DE LAMBERT-BEER establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y otras dos variables: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre a través de la solución. Según esta ley, la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de la luz: A = absorbancia a= coeficiente de absorción, o absortividad A=abc b=longitud del paso de luz en cms (1 cm)

C = concentración de la solución absorbente Esta ecuación constituye la base del análisis cuantitativo de las determinaciones espectrofotométricas. Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorción es una constante, relacionada con la naturaleza química del soluto. La absortividad (a): es la constante de proporcionalidad relacionada con la naturaleza química del producto y tiene unidades que son recíprocas con las de b y c. Cuando C (CONCENTRACION) se expresa en moles por litro (moles/L) y b en cms, El coeficiente de absorción (a) se denomina coeficiente de extinción molar, representado con el símbolo épsilon (ϵ).

ϵ=

A bc

COEFICIENTE DE EXTINCION MOLAR = Lmol -1. Cm-1 El coeficiente de extinción molar es constante para un compuesto dado cuando se fijan condiciones de longitud de onda, pH, solvente, temperatura, y otros factores. Sus unidades son 1/mol x cm. La Ley de Beer tiene una aplicación práctica: determina los métodos experimentales para averiguar la concentración de una sustancia de interés en una solución. Basándonos en la relación lineal entre absorbancia y concentración, podemos conocer la concentración de una solución problema de dos maneras: a)

Por curva de calibración: Es la representación gráfica de la Absorbancia vs. Concentración.

Este método consiste en leer las Absorbancias de varias soluciones de concentraciones conocidas y a continuación graficar en papel milimetrado los datos obtenidos. Antes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un maniobra eliminará las posibles interferencias de absorción o parte de la cubeta o el solvente del cromógeno o reactivo. denomina BLANCO DE REACTIVOS: La lectura inicial se reactivo, antes de adicionarle la muestra.

blanco: ésta reflexión por A este se le hace con el

b)

Por comparación con una concentración conocida:

Se puede también hallar la concentración desconocida de la sustancia procesando en la misma forma una solución estándar o patrón de concentración conocida. Según la Ley de Lambert-Beer la relación concentración /absorbancia es constante: C. Estándar

=

A. Estándar

C. Desconocido A. Desconocido

C. estándar x A (desconocido) C (desconocida)

= A (estándar

Estas dos formas de trabajo sólo son válidas, sí el cromógeno obedece la ley de BEER, y tanto las soluciones estándar como los problemas son leídos en idénticas condiciones. PRACTICA A DESARROLLAR EN EL LABORATORIO: 1. PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN: Usted utilizará concentraciones variables y conocidas de glucosa que se cuantificarán por el método de la glucosa oxidasa (GOD) FUNDAMENTO La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa según la reacción siguiente: GOD Glucosa + O2 + H 2O

ácido glucónico + H2 O 2

El peróxido de hidrógeno formado en esta reacción, reacciona en presencia de peroxidasa (POD) y oxida el cromógeno (4-aminoantipirina/fenol) en un compuesto de color rojo. La cantidad del colorante formado es proporcional a la concentración de glucosa. Procedimiento: Tenga en cuenta las unidades: ml = mililitros; µL= microlitros (UTILICE MICROPIPETA) Marque los 7 tubos de ensayo (utilice un sharpie delgado o cinta) de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo de Glucosa Patrón de glucosa Suero del paciente o desconocido

Blanco 60 mg/dL 90 mg/dL

120 mg/dL

150 mg/dL

180 mg/dL Desconocido

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

10 µL

10 µL

10 µL

10 µL

10 µL

1,0 mL

10 µL

Agite suavemente los tubos, Incube a 37°C por 5 minutos en el baño serológico. Lea la absorbancia de los patrones y desconocido a una longitud de onda de 505 nm. REPORTE DE RESULTADOS Trace una curva de calibración en papel milimetrado colocando las absorbancias en las ordenadas contra las concentraciones de glucosa en mg /dl en las abscisas. Con base en esta curva, calcule la concentración de glucosa del desconocido. Al finalizar su práctica, analice sus resultados y cuestiónese acerca de: a. b. c. d.

¿Cuál es la utilidad de construir una curva de calibración? ¿Qué variables son importantes tener en cuenta para construir la curva? ¿Al construir su curva, observa que se cumplió la Ley de Lambert-Beer, por qué? ¿Podría en ésta misma curva de glucosa, hallar la concentración de creatinina de un paciente ? Argumente su respuesta. e. Compare su procedimiento con los compañeros que trabajaron con el gráfico del Espectro de Absorción. ¿Qué semejanzas y diferencias encuentra entre los dos procedimientos? 2. ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE UN COLORANTE Tome un tubo de ensayo grande y coloque 5 ml de la solución coloreada Tome otro tubo de ensayo de iguales medidas al anterior y agregue 5 ml de agua destilada. Calibre el Espectrofotómetro a l=380 nm con el “Blanco”. En este caso el blanco: es agua destilada. Lea la ABSORBANCIA del colorante. Repita esta operación cambiándola cada 20 nm. Así: l =380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700 nm.

fig. 4: Ejemplos de espectros de absorción

REPORTE DE RESULTADOS Grafique el espectro de absorción del colorante, en papel milimetrado, colocando en las ordenadas los valores de Absorbancia y en las abscisas las diferentes l (longitudes de onda) utilizadas. Al finalizar su práctica, analice sus resultados y responda las siguientes preguntas: a. ¿Cuál es la importancia de conocer el espectro de absorción de una solución? ¿Qué variables tuvo usted en cuenta para construirlo? b. En que longitud de onda leería usted la misma solución de colorante de una concentración de 130 mg/dL, justifique su respuesta. c. Reúnase con sus compañeros que trabajaron la curva de calibración y describa semejanzas y diferencias con su gráfica del espectro de absorción. d. ¿Cuál es la longitud de máxima absorción del espectro de una solución de glucosa?, y en qué región del espectro electromagnético se encuentra? CUESTIONARIO 1.

¿Qué diferencia existe entre absorbancia y absortividad?

2.

¿Cuál es la importancia de la Ley de Lamber Beer?

3. Con base en el espectro del NADH, a qué l sería recomendable medir esta coenzima. 4.

Muestre mediante Espectrofotómetro.

un

breve

esquema

los

elementos

fundamentales

del

5.

Calcule la concentración de una solución de creatinina cuya absorbancia leída fue de 0.50, Teniendo como referencia la concentración de una solución estándar de 2 mg/L con una absorbancia = 0.25. Exprese la concentración en mg/dl.

6.

¿Qué es la creatinina y cuál es su importancia a nivel médico?

7.

El % T de una solución de glucosa medida en el espectrofotómetro es igual a 50. ¿Cuál será el % T cuando la concentración de la solución se hace 3 veces mayor?

8.

El E (Coeficiente de extinción molar) del NADH a 340 nm es 6.22 x 103 litros mol. Si la absorbancia del NADH a l 340 nm es de 0.35. ¿Cuál es la concentración de la coenzima?

9.

Un estándar de Bilirrubina 1 molar se diluye 1:121. La absorbancia de esta solución es = 0.495 en cubeta de 1 cm. ¿Cuál es el E (Coeficiente de extinción) de esta solución de Bilirrubina?

10. ·

Acerca Del Compuesto NAD- NADH, Investigue: a) Cómo sería la gráfica del espectro de absorción del NAD- NADH, compárelos. b) ¿En qué región del espectro electromagnético se encuentra el máximo pico de absorción del NADH?

BIBLIOGRAFIA Kaplan Lawrence A. “Química Clínica” 1ª edición. Buenos Aires, Panamericana PLUMMER, David T. “Introducción a la Bioquímica Práctica” 2ª. Editorial McGrawHill. Latinoamericana S.A. Bogotá, 1981. Casas Luis F. “Bioquímica Experimental” UIS 1988 MERINO, Nohora. “Instrumentación en el Laboratorio Clínico”. Ames Company HENRY R.J. “Química Clínica” Bases y técnicas. Editorial JIMS. Barcelona 1980 Segura, R., Nociones de Fisicoquímica, 1ª Edición, Barcelona, Salvat. 1987 TIETZ, Norbert W. Clinical Chemistry. Tercera Edición. Editorial Saunders. Philadelphia. LABORATORIO DE REGISTROS QUIMICOS- 4 PISO...