GUÍA PARA Examen Final DE Laboratorio DE Bioquímica PDF

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Con esto lograrás comprender todo lo necesario para pasar el examen final de lab de bioca...

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GUÍA PARA EXAMEN FINAL DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Tema 1: Medidas p para ara trabajar con seguridad en el laboratorio - Seguridad en el laboratorio se define como la situación carente de riesgo. - Existen recomendaciones básicas como:  Prohibido fumar  No guardar alimentos o bebidas  Utilizar bata de laboratorio  Los objetos punzocortantes deben manejarse con mucho cuidado y su destino final debe ser la incineración.  Se debe de trabajar con las siguientes normas oficiales: o NOM-055-ECOL-SAA1-1993 o NOM-052-ECOL-SAA1-1993 o NOM-087-ECOL-SAA1-2002 o NOM-166-ECOL-SSA1-1997 - Hay equipos de protección individual de uso habitual como:  Protección para manos: Guantes  Protección para ojos: Lentes de protección  Protección respiratoria: Cubrebocas - Equipos de protección colectiva:  Regaderas de seguridad y lavaojos: fácil acceso a un lavabo en caso de accidentes con sustancias peligrosas. - Los agentes de riesgo potencial en el laboratorio se clasifican en:  Naturaleza química  Naturaleza física  Naturaleza biológica - Todo producto químico es un contaminante tóxico que puede presentar riesgos. - Conocer la señalización normalizada que indica los riesgos y las medidas de seguridad en el laboratorio.

- Los accidentes producidos por equipos suelen por fallas humanas.  Centrifugas  Fuego o Negligencia o Causas eléctricas o Por flama  Radiaciones o Radiación ultravioleta (UV) o Sustancias y elementos radioactivos - Riesgo con Agentes Biológicos  Nivel de Bioseguridad (BSL): Los microorganismos han sido clasificados por la OMS y el CDC. o Clasificación de OMS Grupo

Descripción

Riesgo individual

I

Rara vez causan enfermedad. Causan enfermedad. Tratamiento sencillo. Causan infección grave. Causan infección grave, no hay tratamiento.

Bajo

Riesgo para la comunidad Bajo

Moderado

Limitado

Alto

Bajo o limitado

Alto

Alto

II

III IV

o Clasificación de CDC BSL

Agentes

Prácticas

1

No producen enfermedad

2

Enfermedad humana.

3

Agentes exóticos con potencial de transmisión. Agentes peligrosos que ponen en riesgo la vida.

Prácticas microbiológicas estándar Práctica BSL-1 más: Acceso restringido y señales de advertencia. Práctica BSL-2

4

Práctica BSL-3

Equipos de Bioseguridad (Barrera primaria) No se exige

Instalaciones (Barrera secundaria) Mesa abierta con pileta

Barreras primarias

BSL-1 más autoclave disponible

Barreras primarias

BSL II

Barreras primarias

BLS III

- Rutas de infección en el laboratorio  Por vía aérea  Por vía digestiva  Por vía parenteral - La Norma oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002 detalla los requisitos de eliminación de desechos biológicos. Tipos de residuos Sangre Cultivos y cepas de agentes infecciosos Patológicos Residuos no corporales Objetos punzocortantes

-

Estado físico Líquidos Sólidos

Envasado Recipientes herméticos Bolsas de polietileno

Color Rojo Rojo

Sólidos Líquidos Sólidos Líquidos Sólidos

Bolsas de polietileno Recipientes herméticos Bolsas de polietileno Recipientes herméticos Recipientes rígidos de polipropileno

Amarillo Amarillo Rojo Rojo Rojo

Símbolo universal de riesgo biológico

- Existen las pipetas lineales y las automáticas (o micropipetas)  Líneal: de 1ml a 10 ml  Automática: 2L a 1000L (1mL) Tema 2: Determinaci Determinación ón de pH y soluciones am amortiguadoras ortiguadoras - Los aminoácidos dependen generalmente del pH. - El pH de la sangre humana tiene un rango de 7.36-7.44 - Los ácidos y bases se clasifican en débiles y fuertes por su constante disociación - Cálculo de pH: pH = -log [H+] - Cálculo de pOH: pOH = -log [OH-] - El pH en la sangre arterial es de 7.40 - El pH en la sangre venosa es 7.35 - En toda solución acuosa pH + pOH = 14

- La función de una solución reguladora o tampón o buffer es mantener el pH de una solución acuosa de manera casi invariable. - Ecuación de Henderson Hasselbalch: pH = pKa +

log[𝑆𝐴𝐿] [𝐴𝐶𝐼𝐷𝑂]

- El principal amortiguador extracelular es el bicarbonato. - El principal amortiguador intracelular es el de fosfatos. - Existen dos métodos para medir pH:  Método colorimétrico: Es el más sencillo, basado en indicadores. Indicador

Color del indicador Ácido Base Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Azul

Intervalo de pH

Azul de timol (1er. 1.2 – 2.8 Intervalo) 3.0 – 8.0 Azul de timol (2do. 8.0 – 9.6 Intervalo) Verde de bromocresol Amarillo Azul 4.0 – 5.4 Rojo de fenol Amarillo Rojo 6.8 – 8.2 Fenoftaleína Incoloro Rojo 8.3 – 10.0  Método pontenciométrico: Se basa en las llamadas pilas o celdas de concentración. Se usa un Potenciómetro - En la práctica se usó agua, KH2PO4 y NA2HPO4 para hacer la solución amortiguadora. Tema 3: Determinaci Determinación ón de proteínas totale totaless en suero mediante el método de Biuret - Las proteínas son constituyentes importantes de todas las células. - Existen muchos tipos de proteínas como:  Enzimas  Hormonas  Hemoglobina  LDL  Colágeno - Suero sanguíneo: Líquido amarillo que resulta después de formarse un coágulo sanguíneo. Ahí se encuentran las proteínas globulares como la albúmina y las globulinas.

- La albúmina es la proteína de mayor concentración. Transporta moléculas pequeñas y tiene un papel importante en el mantenimiento de la presión osmótica. - El suero carece de factores de coagulación como el fibrinógeno. - Se cuantifican las proteínas séricas ya que anormalidades en la concentración de estás, detectan alteraciones en tejidos. - Medicamentos como clorpromazina, corticosteroides e isoniazida pueden alterar la medición de proteínas. - Hiperproteinemia: Concentración elevada por estar en estado de defensa. - Hipoproteinemia: Concentración disminuida por perdida severa de proteínas como hemorragias. - En la práctica se usa el método de Biuret. - Se usa el espectrofotómetro para medir la absorbancia. - Se usa la siguiente ecuación: 𝐴𝑏𝑠.𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎 𝐴𝑏𝑠.𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑔/𝑑𝐿

- Los valores normales de proteínas es 6.3 – 8.2 g/dL. Tema 4: Determinaci Determinación ón de la actividad de llaa lactato deshidrogen deshidrogenasa asa (LDH) y su importancia en el diagnóst diagnóstico ico clínico - La enzima LDH se encuentra en todos los tejidos - Es una enzima tetramérica compuesta de cuatro subunidades y dos isoformas (M y H).  LDH-1 (H4): Músculo cardíaco y eritrocitos  LDH-2 (H3M): Reticulocitos y leucocitos  LDH-5 (M4): Hígado y músculo esquelético  LDH-3 y LDH-4: Otros - La concentración de LDH está elevada con pacientes con infarto al miocardio, hepatitis viral, etc. - La LDH cataliza la siguiente reacción: 𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻−→ 𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 - El cálculo se hace:  La disminución de absorbancia por minuto promedio  Multiplicar por el factor = 8095  Resultados en U/L

- Valores normales son 105 – 414 U/L Tema 5: Identificación d dee azúcares de importancia biol biológica ógica mediante reacciones químicas eespecíficas specíficas para monos monosacáridos, acáridos, azúcares reductores, cetoazúcares, pentosa pentosass y polisacáridos. - Los carbohidratos son las moléculas más abundantes de la naturaleza. Son importantes porque funcionan como:  Fuentes de energía  Elementos estructurales  Precursores de la producción de otras biomoléculas - Según el número de unidades de azúcares sencillos que poseen pueden ser clasificados en:  Monosacáridos: Azúcares sencillos o ALDOSAS cuando contienen el grupo aldehído. o CETOSAS cuando contienen el grupo cetona.  Disacáridos: Dos monosacáridos unidos por enlace glucosídico  Oligosacáridos: entre tres y doce monosacáridos  Polisacáridos: Polímeros naturales con varios miles de unidades de azúcares sencillos ligados. - Prueba de Barfoed para la identificación de monosacáridos. (rojo)  Todos los azúcares reductores dan positivo pero los monosacáridos lo hacen más rápido. - Prueba de Benedict para la identificación de azúcares reductores. (rojo) - Prueba de Seliwanoff para la identificación de cetoazúcares. (rojo)  Se usa para el diagnóstico de la Fructosuria esencial. - Prueba de Bial para la identificación de pentosas. (azul)  Diagnóstico de Pentosuria esencial - Prueba del Yodo para la identifiación del almidón (rojo) Solución/Prueba Glucosa Fructosa Xilosa Maltosa Lactosa Sacarosa Almidón Agua destilada

Barfoed + + + -

Benedict + + + + + -

Seliwanoff + + -

Bial + -

Yodo + -

Tema 6: Determinaci Determinación ón de glucosa sanguín sanguínea ea mediante el métod método o de la glucosa oxidasa - Los glúcidos son las moléculas orgánicas más abundantes en la naturaleza. La forma principal es la glucosa. - Si se excede, se convierte en grasa y se almacena en tejidos. - Cuando no hay suficiente, la glucosa se produce de la hidrólisis del glucógeno mediante la gluconeogénesis. - Los exámenes que se utilizanpara el diagnóstico clínico son:  Análisis de sangre (glucemia)  Análisis de orina (glucosuria) - Se usa el método de la glucosa oxidasa - La ecuación usada es: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑒𝑛

𝑚𝑔 𝑑𝐿

- La concentración adecuada sería de 70-105 mg/dL. Tema 7: Determinaci Determinación ón del colesterol ssanguíneo anguíneo mediante un método enzimático - El colesterol es el principal esterol del organismo humano y precursor de los demás esteroides corporales. - El origen del colesterol:  Externa: Alimentos (Huevos, lácteos y carnes)  Endógena: Produce el propio organismo - El hígado es el órgano productor del colesterol. - El colesterol es poco soluble en agua - Las lipoproteínas son complejos mediante el colesterol, TAG y fosfolípidos son transportados a través de la sangre. - LDL- colesterol: Baja densidad, malo. - HDL-colesterol: Alta densidad, bueno. - El aumento de LDL forma placas inestables en las paredes de vasos sanguíneos conocidos como ateromas. - Se le debe indicar al paciente ayuno previo de 12 horas y no ingerir alcohol en 24 horas. - Se usa la siguiente ecuación: 𝑚𝑔 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑒𝑛 𝑑𝐿 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

- Valores normales debajo de 200 mg/dL Tema 8: Análisis gene general ral de orina: Evaluación de ssus us propiedades fís físicas icas y químicas - Uroanálisis: permite detectar alteraciones en el organismo. Se utiliza para evaluar la función de los riñones. - En la orina se elimina urea, creatinina, sodio, potasio y cloro. NO DEBE DE HABER AZÚCAR NI BILIRRUBINA, NI SANGRE. - Puede ser un estudio de muestra única - Puede ser estudio de orina recolectada de 24 hrs. Da una idea más exacta del metabolismo renal y general. - Si se detecta azúcar, puede tener diabetes. - Si se detecta bilirrubina, puede tener alguna enfermedad hepática. - Hay medicamentos que modifican el color de la orina como: Fenotiacina, fenitoína, riboflavina. - Propiedades físicas de la orina  Color: Amarillo claro. o Turbia: Pus o Amarillo oscuro: Presencia de bilirrubina o Rojo: Hemoglobina o Verde: Bacterias  Olor: Aromático o Orina Miel de maple: Huele a miel de maple, metabolismo de aminoácidos. o Fenilcetonuria: Olor a orina de ratón  Volumen: 800 a 1800 mL en 24 hrs.  Densidad: 1.010 a 1.030 g/mL o 1.000 o 1001 g/mL sugiere paciente con diabetes  pH: 4.8 a 8.0 con valor medio de 6.0 - Componentes patológicos de la orina  Proteínas: Solo hay albumina en poca cantidad.  Glucosa: Debe de haber muy poca o nada.  Cuerpos cetónicos: No debe de haber  Bilirrubina: Sugiere enfermedad hepática  Sangre (Hematuria o hemoglobinuria): Puntos hemorrágicos en el sistema genitourinario.

Tema 9: Extracción y análi análisis sis de ADN genómico - ADN: Molécula que necesita la célula para propagarse, información. - Se obtiene de líquidos biológicos, células recuperadas de cultivos celulares, etc. - Técnica que se usa: TSNT  Detergentes: SDS y Tritón X-100 (Desnaturalizan)  Fenol y Sevag (Extraer proteínas)  El ADN se encuentra en fase acousa.  Se usa espectrofotómetro  Evitar nucleasas (ADNasas) 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎

- Factor de dilución: 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 - [ADN] en ng/L = (Factor de dilución) (50) (D.O 260 nm) - Calidad:

𝐷.𝑂 𝑎 260 𝑛𝑚 𝐷.𝑂 𝑎 280 𝑛𝑚

(Menor a 1.8=MALA CALIDAD)

Tema 10: Electrofore Electroforesis sis de ADN en gel de agarosa - Electroforesis: Permite la separación de moléculas como ADN. - Las moléculas de ADN son carga negativa (Anión) se mueven hacía el ánodo (+). - ADN depende de los grupos fosfato. - Soportes: Agarosa (Polisacarido altamente purificado) y poliacrilamida. - Precauciones  Bromuro de etidio (Cancerígeno)  Luz Ultravioleta  Corriente eléctrica Tema 11: PCR para llaa amplificación de un unaa región del gen de la beta globina - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Herramienta más útil en análisis de ácidos nucleicos. - Se necesitan una cadena de ADN “en blanco”, iniciadores y TaqADNpolimerasa. - Son 30 ciclos

- Pasos: Desnaturalización Alineamiento

Temperatura 94°C 57°C

Tiempo 30 segundos 30 segundos

Extensión

72°C

2 minutos

Descripción ADN se separa Iniciadores se unen al ADN molde La TaqADN polimeriza el segmento de ADN a partir de iniciadores.

- Se usa un Termociclador - El gen que se usó en la práctica fue el de la -globina Tema 12: Bioinfor Bioinformática mática médica - Bioinformática: Disciplina emergente que utiliza las tecnologías de la información para capturar, organizar, analizar y distribuir información biológica con el propósito de responder preguntas complejas en biología. Nuevas formas para curar enfermedades. - Genoma humano: Sentó las bases para la disciplina: La Genómica. - Polimorfismos: Cambios en la secuencia - La bioinformática se divide en:  Bioinformática  Biología computacional  Biocomputación - Base de datos  De nucleótidos o GenBank o ADN Databank del Japón  Proteínas o Swissprot o ENZYME o TrEMBL o PIR  Genomas o Ensembl o Wormbase o Flybase  Otras o OMIM (Base de datos que relaciona genes con enfermedades)

o Pubmed - BLAST: se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre secuencias.

FORMULARIO pH - Cálculo de pH: pH = -log [H+] - Cálculo de pOH: pOH = -log [OH-] - En toda solución acuosa pH + pOH = 14 - Ecuación de Henderson Hasselbalch: pH = pKa +

log[𝑆𝐴𝐿] [𝐴𝐶𝐼𝐷𝑂]

Método de Biuret - Se usa la siguiente ecuación: 𝐴𝑏𝑠.𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎 𝐴𝑏𝑠.𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑔/𝑑𝐿

- Valores normales de 6.3 – 8.2 g/dL LDH - La LDH cataliza la siguiente reacción: 𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻−→ 𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 - El cálculo se hace:  La disminución de absorbancia por minuto promedio  Multiplicar por el factor = 8095  Resultados en U/L  Valores normales de 105 – 414 U/L Glucosa oxidasa - La ecuación usada es: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟

𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑒𝑛

- La concentración del estándar es 100 mg/dL - Valores normales de 70-105 mg/dL

𝑚𝑔 𝑑𝐿

Colesterol - Se usa la siguiente ecuación: 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑚𝑔 𝑥 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 = 𝐶𝑜𝑙𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑒𝑛 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝐿

- La concentración del estándar es de 200 mg/dL - Valores normales debajo de 200 mg/dL Extracción y análisis d dee ADN genómico 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎

- Factor de dilución: 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 - [ADN] en ng/L = (Factor de dilución) (50) (D.O 260 nm) 𝐷.𝑂 𝑎 260 𝑛𝑚

- Calidad: 𝐷.𝑂 𝑎 280 𝑛𝑚 (Menor a 1.8=MALA CALIDAD)...