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UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO - FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA DE MEDICINA HUMANA - CURSO INMUNOLOGIA BASICA MANUAL DE PRACTICAS INMUNOLOGIA BASICA

“Año del Bicentenario del Perú: 200 años de Independencia” UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

GUÍA DE PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA BÁSICA S8 – S13

Curso: Inmunología básica

NRC:

Docente:

Horario:

CICLO

TRUJILLO – PERÚ

PRÁCTICA Nro. 08 1

UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO - FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA DE MEDICINA HUMANA - CURSO INMUNOLOGIA BASICA MANUAL DE PRACTICAS INMUNOLOGIA BASICA

PRUEBAS SEROLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO INTRODUCCIÓN: REACCIÓN DE WIDAL: demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea y también mide los antígenos somáticos de S. paratyphí “A”, S. paratyphi "B". Los anticuerpos contra el antígeno O aparecen luego de 6 a 8 días de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses. Los anticuerpos contra el antígeno H aparecen a los 8 a 12 días, alcanzando títulos más elevados con respecto a los anti-O y pueden persistir por más de 1 año. LA PROTEINA C-REACTIVA (PCR); es una proteína sanguínea que forma parte de las denominadas Proteínas de Fase Aguda que tiene la propiedad de precipitar los polisacáridos somáticos de los neumococos. La PCR comúnmente se encuentra aumentada en artritis reumatoidea activa, infecciones virales, tuberculosis, fiebre reumatoidea activa, infarto agudo del miocardio, luego de una operación quirúrgica y de transfusiones sanguíneas. La determinación de PCR indica la intensidad de la enfermedad y la respuesta del paciente a un tratamiento dado. La PCR se detecta en suero por reacción con un anticuerpo específico adsorbido sobre un soporte inerte de látex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinación de las partículas de látex, visible macroscópicamente. LA ARTRITIS REUMATOIDEA; es un Síndrome crónico de origen desconocido; se caracteriza por la inflamación simétrica de las articulaciones. Los factores reumatoideos generalmente de tipo IgM reaccionan con las fracciones Fc. de las IgG. El factor reumatoideo de tipo IgM se detecta en presencia de Gamma-inmunoglobulina o fracción II de Cohn (que actúa como antígeno) adsorbida sobre un soporte inerte de látex poliestireno. El antígeno se une a los FR (anti - IgG) produciendo una aglutinación de las partículas de látex poliestireno, visible macroscópicamente. ANTIESTREPTOLISINA-O (AS0) es la medición de anticuerpos anti-Estreptococo betahemolíticos del tipo A (Streptococcus pyogenes). Esta bacteria produce una enzima llamada estreptolisina O, que puede destruir los hematíes y el cuerpo reacciona contra ella produciendo anticuerpos específicos antiestreptolisina O. La presencia de títulos altos de antiestreptolisinas O ó ASLO, indican una infección por la bacteria Estreptococo betahemolíticosdeltipoA,quepuedeproducirunaglomerulonefritis,unafiebrereumática,una endocarditis bacteriana o una escarlatina.

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SÍFILIS: es una infección sistémica de evolución crónica, con períodos asintomáticos, causada por Treponema pallidum. Es un patógeno exclusivo del hombre, quien es su único reservorio. Se adquiere por contacto directo con una lesión de sífilis reciente, por vía transplacentaria y raramente por transfusión de sangre. T. pallidum penetra a través de mucosa sana o piel erosionada y rápidamente disemina en el organismo, por lo que desde etapas precoces la infección es sistémica. Las pruebas serológicas no treponémicas como el VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) o RPR (Rapid Plasma Reagin) son fáciles de realizar, tienen escaso costo económico, son útiles para el diagnóstico y esenciales para controlar la respuesta al tratamiento, para lo cual se necesita que el estudio sea cuantitativo. Resultan reactivas después de 14 a 20 días de aparecido el chancro.

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Aunque estas pruebas habitualmente se negativizan después del tratamiento, en algunos pacientes persisten reactivas por el resto de su vida, pero con títulos bajos. Un descenso no significativo de los títulos o un nuevo ascenso después del tratamiento, hace sospechar fracaso terapéutico o reinfección. El objetivo de la práctica es: 1. Realizar in vitro pruebas serológicas como criterios de diagnóstico. MATERIAL Y MÉTODOS: 1. REACCIÓN DE WIDAL: (Aglutinaciones)



Sobre una placa de cristal “escavada” se coloca en fila 80 uL de suero del paciente sin diluir (5 en total).

Agregar 1 gota de los antígenos

correspondientes para S. typhí "O", S. typhí "H", S. paratyphi "A", S. paratyphi "B” y Brucela. Se mezcla el suero con el antígeno, mover la placa varias veces hacia atrás y



hacia adelante por 5 minutos y se procede a la observación de una reacción de aglutinación visible. Con los antígenos positivos repetir con cantidades de 40, 20, 10 y 5 uL,



respectivamente. Con este procedimiento los anticuerpos resultan titulados en 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320, respectivamente. Negativo: No hay aglutinación. Positivo: Aglutinación. Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce la aglutinación. 2. PROTEÍNA C – REACTIVA



Preparar una muestra diluida 1:20 de suero en un tubo de ensayo, mezclando 1 gota (50uL) del suero con 1 mL. de buffer glicina. Luego, en una placa de vidrio mezclar una gota (50 uL) del reactivo de látex y una gota (50 uL) del suero diluido.



Inmediatamente poner en marcha el cronómetro, balanceando suavemente la placa de vidrio por tres minutos. Observar la aglutinación sobre un fondo negro y por encima de un haz luminoso.

Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas de: 1:40, 1:80, 1:160, etc. Negativo

:

No hay aglutinación

Positivo

:

Aglutinación que aparece a los tres minutos.

Título

:

Inversa de la máxima dilución en la que se observa aglutinación.

3. ARTRITEST: 

Diluir una muestra de suero 1: 20 con buffer glicina. En una placa de vidrio colocar separadamente el suero diluido 1 gota (50 uL) y una gota de reactivo de látex-globulina. Mezclar con un palillo descartaba hasta obtener una suspensión uniforme,



Inmediatamente disparar el cronómetro, balanceando suavemente la placa de vidrio observando el resultado dentro de los dos minutos.



Para la titulación de los sueros se hacen diluciones en tubos, colocando 1,9 mL de buffer glicina en el primer tubo y 1 mL en los restantes.



Agregar 0,1 mL de suero al tubo Nº 1 mezclando, luego transferir 1 mL de la dilución al tubo Nº 2, y así se continua con el resto de los tubos. Se obtienen diluciones de 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, etc. Negativo:

No se ve aglutinación.

Positivo:

Aglutinación dentro de los dos minutos.

Título: Inversa de la máxima dilución en la que se produce aglutinación. 4. ANTIESTREPTOLISINA-O (ASO) 

Llevar los reactivosylamuestraatemperaturaambiente. Agitar el Reactivo Aantes de usar, vaciando previamentelapipetadelgotero.



En uno delos sectores delimitados dela placa adjunta al equipo colocar: 1 gota del Reactivo A(25ul)másla muestra ycontroles25ul.



Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensiónuniforme enlasuperficie delimitada delaplaca.



Inmediatamente disparar un cronómetro, balancear suavemente la placa y observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos. Negativo: suspensión homogénea. Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1 a 4 +. Título: inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente.

5. El VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipina para detectar anticuerpos antitreponémicos inespecíficos, del tipo reagina, producidos por el individuo ante una infección sifilítica. 

En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo VDRL, agitar constantemente por 5 minutos y observar al microscopio con objetivo 10X la floculación formada.



Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, colocando una gota del suero diluido más una gota del reactivo VDRL. Negativo:

No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo:

Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.

Título:

Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.

6. El RPR es una prueba de floculación diseñada para detectar reagina en el suero de pacientes con sífilis de manera rápida. La muestra se mezcla con una suspensión que posee cardiolipina, lecitina y colesterol en partículas de carbón.



En una lámina colocar una gota de suero más una gota del reactivo RPR, agitar constantemente por 5 minutos y observar floculación visible.



Para titulación del suero se hacen diluciones en SSF al ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, colocando una gota del suero diluido más una gota del reactivo RPR. Negativo:

No se ve floculación, se informa como No Reactivo

Positivo:

Floculación a los 5 minutos. Se informa como Reactivo.

Título:

Inversa de la máxima dilución en la que se produce floculación.

TAREA DE LABORATORIO: 1. Defina que es una reacción serológica directa e indirecta

-

Reacción serológica directa: Son aquellas que basadas en el principio de la reacción antígeno anticuerpo investigan la presencia del antígeno.

-

Reacción serológica indirecta: Son aquellas que basadas en la reacción antígeno anticuerpo, investigan no ya, el agente en sí, sino la huella que dejó éste al pasar por su huésped en términos de una respuesta inmune puesta en evidencia por el hallazgo de anticuerpos específicos contra el agente o alguno de sus componentes y que, indirectamente permite suponer que el agente en cuestión estuvo presente en el huésped en algún momento. 2. Defina que es reacción serológica de aglutinación y precipitación

-

Reacción de aglutinación: es una reacción inmunoquímica que produce la agregación de bacterias o células recubiertas de antígeno o anticuerpo.

-

Reacción de precipitación: ocurre cuando al mezclar sustancias iónicas, los iones existentes en el medio tienden a estar unidos, formando un precipitado.

3. Defina que es una reacción de aglutinación pasiva.

También llamada reacción de aglutinación indirecta, se basa en el empleo de una partícula aglutinante inerte a la cual se la ha unido un antígeno, en otras palabras, se basa en la sensibilización de la partícula inerte con el Ag, por lo que resultan útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos biológicos 4. Diga a qué tipo de reacción serológica corresponden las pruebas realizadas en el laboratorio.

Corresponden al tipo de reacción serológica de aglutinación puesto que debido a la presencia o ausencia de esta aglutinación se determinará la presencia o no de un antígeno.

5. Diga porque las pruebas de VDRL y RPR son consideradas no treponémicas. Mencione que pruebas serológicas son del tipo treponémicas. Porque este tipo de pruebas se caracterizan por hacerse con rapidez y no son exclusivas para la sífilis. Determinan Ac reagínicos siendo el Ag usado la cardiolipina-lecitina. Asimismo, las pruebas serológicas del tipo treponémicas son la FTA.ABS que es la que es usada más frecuente.

6. Coloque fotos de material usado en la práctica

7. Coloque fotos de resultados de la práctica

A S O

PRÁCTICA Nro. 09 ELISA Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas INTRODUCCIÓN: ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo, en la cual una enzima ligada a un complejo antígeno – anticuerpo es capaz de generar un producto detectable con cambio de color. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba; por lo tanto, como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, o que ha sido vacunado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña. En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo. En estos casos, normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. Las enzimas que componen el conjugado deben reunir condiciones como la temperatura de catálisis semejante a la de la reacción antígeno-anticuerpo; dar productos colorados y solubles al degradar el substrato; y no dar productos intermedios de catálisis. Las enzimas más empleadas son la fosfatasa alcalina (con substrato p-nitrofenil fosfato o dietanolamina en bufer carbonato pH 9,6) la peroxidasa (con substrato ortofenilendiamina) y la betagalactosidasa (son substrato o.nitrofenil-beta-galactosido) Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución (DIRECTO), la detección de un anticuerpo

(INDIRECTO) en una solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo (INDIRECTO). A continuación se describen los más comunes. 1. ELISA directo Sandwich “DAS” (Double Antibody Sandwich). Principio: Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la muestra problema conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de anticuerpos monoclonales específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos (2da. Reacción Ag-Ac). Adición de un substrato para la enzima y luego una

sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del color en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de negatividad, no aparecerá ningún color. 2. ELISA directo doble Sándwich “HADAS”. Principio: Fijación al soporte de anticuerpos específicos del antígeno. Adición de la muestra problema conteniendo el antígeno (Reacción Ag-Ac). Adición de anticuerpos monoclonales específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte). (2da reacción Ag-Ac). Agregar anti-anticuerpos (contra el 2do. Ac) conjugados con una enzima (3ra. Reacción Ag-Ac). Adición de un substrato para la enzima y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del color en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de negatividad, no aparecerá ningún color. 3. ELISA Indirecto Principio: En el soporte se encuentra fijado el antígeno, se agrega la muestra que contiene el anticuerpo que capta al antígeno fijado (reacción Ag-Ac). Se adiciona antianticuerpos conjugados con una enzima. Se agrega el sustrato de la enzima usada y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Se realiza la lectura del color en forma visual (cualitativa) o usando lectores especiales para cuantificar. En caso de negatividad, no aparecerá ningún color. 4. ELISA Directo Competitivo Principio: En el soporte se encuentran fijados los anticuerpos. Se agrega en forma simultánea la muestra que contiene el antígeno problema y una concentración conocida (comercial) del mismo Ag marcado con una enzima. Se agrega el sustrato de la enzima usada y luego una sustancia reveladora de haber ocurrido la reacción enzimática. Si la muestra es negativa la lectura de color será mayor a que si la muestra contiene al antígeno, Estas lecturas deberán ser confrontadas con la curva de calibración respectiva. Como puede observarse, los dos antígenos agregados están compitiendo con el anticuerpo fijado en el soporte. También puede utilizarse el ELISA competitivo para detectar anticuerpos. 5. ELISA Directo de inhibición

Principio: En el soporte se encuentran fijados los antígenos. Se agrega en forma simultánea la muestra que contiene el antígeno, más un anticuerpo específico marcado con una enzima. En este paso se establece una reacción de inhibición entre del Ag (muestra) con el Ac marcado, impidiendo que este último se una al Ag del soporte. Con el lavado se eliminan el anticuerpo no fijado al Ag del soporte y se determina la cantidad de anticuerpo marcado que se ha inmovilizado. Se construye una curva de calibrado representando la cantidad de anticuerpo marcado inmovilizado frente a la concentración de antígeno soluble añadida. Puede emplearse también el inhibitorio indirecto. Objetivo de la práctica: 1. Conocer las técnicas y el fundamento que se usan para los distintos ELISA.

I.

MATERIAL Y MÉTODOS

ELISA directo Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich). 1. Anticuerpo fijado en el soporte 2. Agregar la muestra con el antígeno problema (Reacción Ag-Ac) 3. Agregar anticuerpo monoclonal contra el Ag que va marcado con enzimas 4. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador. 5. Leer cualitativamente a la presencia de color o cuantitativamente en fotocolorímetro. ELISA directo doble Sándwich “HADAS” 1. Anticuerpo fijado en el soporte 2. Agregar la muestra con el antígeno problema (Reacción Ag-Ac) 3. Agregar anticuerpo monoclonal contra el Ag 4. Agregar un anti anticuerpo que va marcado con enzimas 5. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador. 6. Leer cualitativamente a la presencia de color o cuantitativamente en fotocolorímetro. ELISA Indirecto 1. Antígeno fijado en el soporte 2. Agregar la muestra con el anticuerpo problema (Reacción Ag-Ac) 3. Agregar anti-anticuerpo que va marcado con enzimas 4. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador. 5. Leer cualitativamente a la presencia de color o cuantitativamente en fotocolorímetro. ELISA competitivo para anticuerpos (Indirecto) 1. Antígeno fijado en el soporte. 2. Agregar la muestra con el anticuerpo problema y simultáneamente el mismo tipo de anticuerpos marcadas con una enzima. 3. Adicionar sustrato para la enzima y el revelador. 4. Leer al fotocolorímetro: ausencia de color, color tenue, color intenso y confrontar la lectura con la curva de calibración.

ELISA directo Sandwich “DAS”

ELISA directo doble Sandwich “HADAS”

II.<...