Identifikasi Candida spp. dengan Medium Kromogenik Candida spp Identification Using Chromogenic Medium PDF

Preview

Summary

Artikel Penelitian Identifikasi Candida spp. dengan Medium Kromogenik Retno Wahyuningsih,*,** Syarifah M. Eljannah,* Mulyati* *Departemen Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia **Bagian Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Indonesia Abstrak Pendahuluan: Identifikasi C...

Description

Artikel Penelitian

Identifikasi Candida spp. dengan Medium Kromogenik

Retno Wahyuningsih,*,** Syarifah M. Eljannah,* Mulyati* *Departemen Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia **Bagian Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Indonesia

Abstrak Pendahuluan: Identifikasi Candida penting untuk diagnosis dan penentuan jenis obat. Identifikasi konvensional dilakukan dengan asimilasi-fermentasi gula yang membutuhkan waktu lama. Penelitian ini bertujuan membandingkan secara konvensional dan medium kromogenik. Metode: Dilakukan penelitian terhadap jamur kandida yang diisolasi dari 340 bahan klinik yang diterima oleh laboratorium mikologi Departemen Parasitologi FKUI. Semua bahan klinik tersebut telah dibiakkan pada agar saboroaout dekstrosa. Suspensi Isolat Candida ditanam dalam CHROM agar Candida (CAC) pada suhu 35-37oC selama 48 jam. Sebagai baku emas digunakan uji fermentasi asimilasi sesuai cara Wikerham. Hasil: Medium CAC mampu mengidentifikasi lima spesies yaitu Candida tropicalis, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabrata dan Candida krusei. Identifikasi dengan metode konvensional menghasilkan 15 spesies Candida, dua spesies Trichoporon dan satu spesies Rhodotorula. Kesimpulan: Medium CAC dapat digunakan sebagai medium isolasi dan identifikasi untuk beberapa spesies Candida, serta dapat membedakan C. albicans dengan empat spesies Candida penyebab infeksi sistemik. Spesies lain memerlukan pemeriksaan lanjutan dengan metode konvensional. J Indon Med Assoc. 2012;62:83-9. Kata kunci: medium kromogenik, asimilasi-fermentasi, Candida, Trichosporon, Rhodotorula

J Indon Med Assoc, Volum: 62, Nomor: 3, Maret 2012

83

Identifikasi Candida spp. dengan Medium Kromogenik

Candida spp Identification Using Chromogenic Medium Retno Wahyuningsih,*,** Syarifah M. Eljannah,* Mulyati* *Department of Parasitology, Faculty of Medicine Universitas Indonesia, **Department of Parasitology, Faculty of Medicine Universitas Kristen Indonesia

Abstract Introduction: Candida identification is important for the diagnosis and prediction of antifungal. Normally, identification is performed using conventional methods, which is time-consuming. Chromogenic medium is expected to give faster result. In this study we compare Candida identification using chromogenic media and conventional methods. Methods: A total of 340 isolates were collected from clinical specimen submitted to the mycologylaboratory of Parasitology FMUI. All specimens were already cultured in dextrose saboroaout agar. Suspencions of candida isolates were then cultured in CHROM agar. Candida (CAC) in 35-37oC for 48 hrs. As gold standard Wikerham Fermentation Assimilation test (Conventional test) was used. Result: The CAC medium is able to identify 148 isolates (43.5%) consisting of Candida tropicalis, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabrata and Candida krusei, while 192 isolates (56.5%) were unidentified. By conventional methods 15 species of Candida, two of Trichoporon and one of Rhodotorula were identified. Chromogenic medium can be used as a isolation and identification medium, and distinguish C. albicans from four other species that might cause systemic infection. Conclusion: CAC medium can be used as isolation and identification medium for some candida species, and also can differentiate C. albicans with other sistemic candida. Outside that five species conventional methods four night be needed. J Indon Med Assoc. 2012;62:83-9. Keywords: Chromogenic medium, assimilation-fermentation, Candida, Trichosporon, Rhodotorula

Pendahuluan Candida adalah jamur golongan khamir yang terdiri dari banyak spesies, namun hanya sekitar 17 spesies yang dilaporkan dapat menginfeksi manusia. Spesies tersebut antara lain Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida kefyr, Candida guilliermondii, Candida lusitaniae, Candida dubliniensis. Selain menyebabkan infeksi Candida diketahui dapat hidup sebagai komensal dalam tubuh manusia dan dapat dapat berubah menjadi patogen bila keadaan menguntungkan, misalnya pada pasien imunokompromais. Spesies yang paling sering menimbulkan infeksi superfisial maupun sistemik pada manusia adalah C. albicans yaitu sekitar 70-80%, diikuti oleh C. tropicalis sekitar 3040%.1-4 Isolasi jamur termasuk Candida dari bahan klinik umumnya dilakukan dengan menanam spesimen ditanam pada medium agar sabouraud dekstrosa (ASD) yang lazim digunakan untuk isolasi berbagai jenis jamur. Pada medium tersebut semua spesies Candida tumbuh sebagai koloni ragi atau koloni seperti ragi yang tidak dapat dibedakan satu sama lain baik secara makroskopis maupun mikroskopis. Untuk identifikasi spesies diperlukan uji fermentasi-asimilasi dan morfologi yang dikenal sebagai cara konvensional dan 84

membutuhkan waktu 7-21 hari sehingga diagnosis pasti secara dini sukar ditegakkan.5 Keberhasilan pengobatan antara lain dipengaruhi sensitivitas jamur terhadap antifungal yang berbeda-beda dan tergantung pada spesies. Ketidaktepatan identifikasi dapat menyebabkan kegagalan terapi. Contohnya, penyebab tersering kandidosis orofarings adalah C. albicans yang umumnya peka terhadap flukonazol, namun ada penyebab lain yaitu C. dubliniensis yang sangat mirip dengan C. albicans namun kurang sensitif terhadap flukonazol. 6-9 Identifikasi sampai tingkat spesies akan memudahkan pilihan obat dan mencegah kegagalan terapi. Identifikasi Candida sampai tingkat spesies penting untuk menegakkan diagnosis, dan memprediksi kepekaan jamur terhadap obat antifungal sehingga obat yang diberikan sesuai. Akhir-akhir ini terjadi peningkatan tajam infeksi sistemik yang disebabkan Candida, karena bertambahnya pasien imunokompromais oleh berbagai sebab. Di Amerika Serikat, dilaporkan bahwa Candida spp. merupakan mikroorganisme peringkat ke-4 yang diisolasi dari darah pasien rawat inap sedangkan di Eropa menduduki peringkat ke-6. Mortalitasnya berkisar antara 50 - 90% dan pasien dengan kandidemia dapat meninggal dalam satu minggu setelah terjadi fungemia.10,11 J Indon Med Assoc, Volum: 62, Nomor: 3, Maret 2012

Identifikasi Candida spp. dengan Medium Kromogenik Identifikasi spesies jamur membutuhkan waktu yang lama diperlukan cara identifikasi yang cepat dan mudah. Untuk mengatasi lamanya proses identifikasi dengan metode konvensional, saat ini telah tersedia medium kromogenik yang mampu membedakan spesies Candida berdasarkan perbedaan warna koloni yang tumbuh pada medium tersebut. Warna yang terbentuk merupakan hasil reaksi enzimatik yang spesifik untuk masing-masing spesies. Dengan metode tersebut identifikasi dapat dilakukan dengan cepat karena hanya diperlukan waktu 24-48 jam setelah inokulasi.12-14 Berbagai media kromogenik telah tersedia di pasaran, seperti Candiselect (Sanofi Diagnostics Pasteur, Perancis) dan Albicans ID (bioMerieux, Perancis). Medium tersebut umumnya digunakan untuk identifikasi C. albicans.15 Medium yang telah tersedia di Indonesia adalah CHROMagarCandida (Paris, Perancis) yang dapat mengidentifikasi spesies yang sering mengakibatkan penyakit seperti C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, dan C. glabrata. 12,16 Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sensitifitas serta spesifisitas medium CHROMagar-Candida (CAC) dalam mengidentifikasi Candida galur yang ada di Jakarta yang berasal dari berbagai bahan klinik. Metode Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikologi, Departemen Parasitologi FKUI sejak tahun 2004. Bahan penelitian adalah jamur koleksi Departemen Parasitologi FKUI. Jamur yang digunakan berasal dari bahan klinik darah, sputum, tinja, urin, kerokan kulit, sekret vagina, usap mulut dan fistula. Sebelum disimpan semua bahan klinik dibiak pada media agar sabouraoud dekstrosa (ASD) yang mengandung kloramfenikol 0,5 mg/ml (ASD +) dan tidak mengandung kloramfenikol ASD (-). Selanjutnya jamur dimurnikan dan disimpan kemudian disegarkan sebelum digunakan untuk identifikasi dengan media kromogenik dan metode konvensional. Pemurnian Candida yang tumbuh pada biakan primer ditujukan untuk mendapat koloni tunggal. Biakan primer biasanya menghasilkan koloni yang tumbuh menyatu atau berdekatan satu sama lain. Untuk mendapatkan koloni tunggal maka dipilih empat koloni berbeda yang tumbuh terpisah untuk diidentifikasi. Koloni tersebut disuspensi dalam 1 ml akuades dengan konsentrasi 105 sel/ml. Selanjutnya suspensi Candida ditanam pada ASD (+) dalam cawan petri dan diperam dalam suhu kamar (±26oC) selama 2-3 hari. Setelah dimurnikan jamur siap untuk diidentifikasi dengan medium kromogenik dan metode konvensional. Untuk identifikasi dengan medium kromogenik digunakan CHROMagar-Candida (CAC- Kat. no. CA220, Paris-France) yang telah tersedia di Indonesia. Medium CAC disiapkan sesuai dengan aturan produsen. Untuk menanam jamur dalam media tersebut, dibuat suspensi Candida dengan konsentrasi McFarland 0,5 (5x106 sel/ml) yang dihomogenkan dengan vorteks supaya sel jamur saling J Indon Med Assoc, Volum: 62, Nomor: 3, Maret 2012

terpisah. Selanjutnya suspensi Candida ditanam pada media CAC dan dibungkus dengan kertas aluminium untuk menghindari pengaruh cahaya dan diinkubasi pada suhu 3537oC selama 48 jam. Spesies ditentukan berdasarkan warna koloni yang tumbuh. Candida albicans tumbuh sebagai koloni hijau terang (HT) dengan bagian tepi memucat, C. tropicalis berwarna ungu tua di puncak koloni dan bagian tepi ungu pucat, sedangkan koloni C. krusei berwarna merah muda dengan permukaan kasar, dan C. parapsilosis tumbuh sebagai koloni berwarna putih pucat dan koloni C. glabrata berwarna merah muda gelap dengan bagian tepi memucat.12,13 Sebagai baku emas digunakan metode klasik (fisiologi) uji fermentasi-asimilasi sesuai dengan cara Wickerham.5 Uji fermentasi karbohidrat dilakukan untuk mengetahui kemampuan Candida dalam memecah karbohidrat tertentu sehingga menurunkan pH media basal menjadi asam yang terlihat sebagai perubahan warna indikator dan terbentuknya gas dalam tabung Durham. Karbohidrat yang dipakai adalah glukosa, galaktosa, sukrosa, maltosa, laktosa dan trehalosa5 dengan konsentrasi 6% yang disterilkan dengan cara filtrasi menggunakan filter berdiameter pori 0,2 µm (Sartorius AG, Jerman). Konsentrasi sel Candida yang ditanam dalam medium adalah 5x106sel/ml. Fermentasi dianggap positif (P) bila terjadi perubahan warna hijau menjadi kuning, dan P+ jika terjadi perubahan warna dan terbentuk gas dalam tabung Durham. Fermentasi dianggap negatif (N) bila tidak terjadi perubahan warna pada media setelah 21 hari inkubasi. Penentuan spesies Candida dilakukan dengan mencocokkan pola fermentasi yang terbentuk dengan acuan.5,17 Uji asimilasi karbohidrat dilakukan untuk melihat kemampuan Candida dalam menggunakan karbohidrat sebagai sumber energi. Uji asimilasi dilakukan dengan menanam Candida dalam campuran medium basal (6,7 g yeast nitrogen base (YNB) dan 5 g karbohidrat: glukosa, maltosa, sukrosa, trehalosa, galaktosa, mellibiosa, selobiosa, inositol, D-xylosa dan pati/starch, kecuali raffinosa sebanyak 10 g). Masing-masing dilarutkan dalam 100 ml akuades steril, dan bila perlu dipanaskan. Larutan disterilkan memakai filter-cellulose acetate, dengan pori 0,2 µm (Sartorius AG, Jerman). Untuk kontrol digunakan medium YNB tanpa karbohidrat. Biakan diinkubasi pada suhu kamar (25°C) paling lama 21 hari. Asimilasi dianggap positif (P) bila terjadi kekeruhan pada media dan dianggap negatif bila media tetap jernih setelah 21 hari inkubasi. Penentuan spesies Candida dilakukan dengan mencocokkan pola asimilasi yang terbentuk dengan acuan.5,17 Identifikasi secara morfologi dilakukan pada biakan tipis corn meal agar (CMA) untuk melihat pertumbuhan hifa dan spora. Pemeriksaan dilakukan menurut cara Halley dan Callaway, hasilnya dicocokan dengan acuan.3,5,17 Statistik Untuk mencari kesesuaian antara metode konvensional dan medium CAC dilakukan uji McNemar. Selain itu juga dihitung spesifisitas, sensitivitas, nilai prediksi positif dan 85

Identifikasi Candida spp. dengan Medium Kromogenik negatif medium CAC. Hasil Pemeriksaan dilakukan terhadap 134 bahan klinik yang berasal dari 134 pasien dengan dugaan menderita kandidosis dan dikirim ke Laboratorium Mikologi Departemen Parasitologi FKUI untuk diagnosis. Dari biakan primer kemudian didapat 340 isolat Candida spp. yang selanjutnya diidentifikasi dengan cara konvensional dan dengan media kromogenik. Bahan klinik tersebut berasal dari 46 pasien lakilaki (34,3%) dan 69 pasien perempuan (51,5%) sedangkan 19 pasien (14,2%) tidak tercatat jenis gendernya. Darah merupakan bahan klinik terbanyak (87 sampel) yang terdiri dari 52 sampel neonatus, dua sampel bayi, lima sampel anak, sembilan sampel dewasa dan 19 sampel tidak diketahui usianya. Terdapat 26 sampel bahan klinik usap vagina; lima sampel remaja dan 21 sampel dewasa, Bahan klinik lain seperti tinja, sputum, kerokan kulit, urin, fistula, usap mulut diperoleh dalam jumlah yang lebih sedikit. Identifikasi spesies Candida dengan medium CAC pada 340 isolat, didapatkan 148 isolat (43,5%) dapat diidentifikasi, sedangkan 192 isolat (56,5%) tidak dapat diidentifikasi. Identifikasi spesies Candida dengan medium CAC didasarkan atas warna koloni yang tumbuh. Sebaran spesies berdasarkan warna koloni yang tumbuh pada medium CAC. Spesies terbanyak yang dapat diidentifikasi adalah C. tropicalis 73 isolat (21,47%), C. albicans 40 isolat (11,76%), C. parapsilosis 20 isolat (5,88%), C. glabrata tujuh isolat (2,06%) dan C. krusei hanya satu isolat. Semua menghasilkan koloni dengan tesktur halus kecuali Trichosporon sp. Media CHROMagar-Candida dapat mengidentifikasi lima spesies Candida dan satu genus Trichosporon berdasarkan warna dan tipe koloni yang tumbuh pada agar tersebut (Tabel 1). Dalam penelitian ini, sebanyak 73 isolat C. tropicalis yang teridentifikasi memperlihatkan warna ungu tua pada puncak koloni dengan tepi ungu pucat, sedangkan C. albicans memberikan warna hijau terang. Candia parapsilosis membentuk warna koloni putih hingga merah muda pucat (pale pink), warna koloni merah muda pucat dibentuk oleh C. glabrata dengan tipe koloni halus dan C. krusei dengan tipe koloni kasar. Spesies lain seperti C. guilliermondii, C. pelliculosa, C. lusitaniae tidak memberikan warna yang khas yaitu membentuk warna koloni ungu dan merah muda. Identifikasi berdasarkan fisiologi jamur menghasilkan 15 spesies Candida, dua spesies Trichoporon dan satu spesies Rhodotorula. Dengan cara konvensional spesies paling banyak yang diidentifikasi dari darah adalah C. tropicalis (39 sampel), tinja (enam sampel), usap vagina (tiga sampel), sputum, urin dan kerokan kulit masing-masing satu sampel. Candida albicans ditemukan pada usap vagina (18 sampel), C. krusei hanya ditemukan dari feses dan C. famata dari usap mulut. Spesies lain yang jarang diisolasi dari bahan klinik adalah C. pelliculosa, C. langeronii, C. intermedia, C. mogii. dan C. 86

Tabel 1. Perbandingan Metode Fermentasi-Ssimilasi, CHRO Magar-Candida dan Corn Meal Agar Spesies

Fermentasiasimilasi

CHRO Magar

Corn Meal Agar

C. tropicalis C. albicans C. parapsilosis C. glabrata C. guilliermondii C. krusei Candida spp. Trichosporon sp. Tidak teridentifikasi

90 58 10 0 34 1 115 32 10

73 40 20 7 0 1 0 7 192

13 58 10 8 65 1 0 31 157

Jumlah

340

340

340

lusitaniae (Tabel 1). Spesies terbanyak yang diidentifikasi dengan metode fisiologi-morfologi adalah C. tropicalis 26,47%, C. albicans 17,05%, C. pelliculosa 12,64% dan C. guilliermondii 10%, sedangkan spesies lain ditemukan dalam jumlah yang lebih sedikit. Identifikasi dengan metode fisiologi mampu mengidentifikasi seluruh isolat yang diperiksa, sedangkan metode morfologi (CAC dan CMA) tidak dapat mengidentifikasi seluruh isolat yang diperiksa yaitu hanya 192 isolat dengan CAC dan 157 isolat dengan CMA yang dapat diidentifikasi. Spesifitas dan sensitivitas CHROMagar-Candida dalam mengidentifikasi isolat Candida spp dihitung berdasarkan kemampuannya untuk identifikasi tiap spesies. Media CAC memiliki spesifisitas dan sensitivitas untuk C. tropicalis 80,8% dan 27,8%, C. albicans 99,3% dan 65,5%, C.parapsilosis 96,9% dan 100%, Trichosporon sp., 100% dan 21,8%. Berdasarkan uji McNemar, tidak terdapat kesesuaian hasil antara CHROMagar-Candida dengan baku emas (p>0,05) dalam mengidentifikasi C. tropicalis. Sedangkan untuk identifikasi C. albicans, C. parapsilosis dan Trichosporon sp terdapat kesesuaian hasil yang bermakna (p0,05). Spesies yang jarang menginfeksi manusia seperti C. guilliermondii, C. pelliculosa, dan C. mogii tidak dapat diidentifikasi oleh medium CAC dan dilaporkan sebgai Candida sp. Sebanyak 192 (56,7%) dari 340 isolat yang diteliti tidak dapat diidentifikasi oleh CAC termasuk spesies yang jarang ditemukan. Melihat hasil identifikasi medium CAC tidak sebaik metode asimilasi-fermentasi dalam mengidentifikasi Candida sampai tingkat spesies. Kemampuannya terbatas pada spesies yang dianggap sering menyebabkan infeksi. Hal itu sesuai dengan penelitian lain yang memperlihatkan kemampuan CAC dalam mengidentifikasi spesies penting yang sering menyebabkan kelainan pada manusia. 19-21, Kemampuan CAC untuk mengidentifikasi lima spesies penting penyebab kandidosis hanya dalam waktu 48 jam sangat membantu dalam penanganan kandidosis, namun bila terjadi kegagalan identifikasi diperlukan konfirmasi dengan metode fermentasi-asimilasi/morfologi.

J Indon Med Assoc, Volum: 62, Nomor: 3, Maret 2012

Pada penelitian ini ditemukan ketidaksesuaian identifikasi antara medium CAC dan metode konvensional fisiologi-morfologi. Sebanyak 20 isolat yang diteliti teridentifikasi oleh medium CAC sebagai C. parapsilosis karena pembentukan koloni berwarna putih, ternyata hanya 10 isolat yang terindentifikasi sebagai C. parapsilosis dengan metode fisologi-morfologi sedangkan 10 isolat lainnya teridentifikasi sebagai C. tropicalis (lima isolat), C. albicans (dua isolat), C. langeronii (satu isolat) dan C. mogii (dua isolat). Hasil identifikasi yang berbeda antara CAC dengan metode fisiologi-morfologi juga ditemuan pada spesies lainnya yaitu tujuh isolat teridentifikasi sebagai C. glabrata karena memiliki koloni berwarna merah muda, tetapi setelah dikonfirmasi dengan fisiologi-morfologi ternyata semuanya teridentifikasi sebagai C. intermedia (dua isolat), C. fennica ( satu isolat), C. tropicalis (satu isolat), C. guilliermondii (satu isolat), C. langeronii (satu isolat) dan Rhodotorulla rubra (satu isolat). Metode fermentasi-asimilasi dan morfologi selama ini dianggap sebagai baku emas dan telah digunakan secara luas serta dikenal memiliki kemampuan tinggi dalam identifikasi berbagai spesies Candida. Metode fermentasi-asimilasi menilai kemampuan jamur dalam metabolism berbagai karbohidrat dan sumber karbon, sementara media kromogenik dalam hal ini CHROMagar-Candida hanya menilai reaksi enzimatik yang terlihat sebagai pembentukan warna pada koloni yang tumbuh dan seringkali sulit dibedakan terutama pada koloni yang tumbuh sebagai koloni berwarna merah muda dan keunguan. Pada penelitian ini C. tropicalis membentuk koloni berwarnga ungu di bagian puncak dan tepi ungu pucat, tetapi selain itu jamur tersebut juga akan membentuk warna merah muda-merah muda pucat-putih.15,20 Menurut Willinger et al,15 besar kemungkinan C. tropicalis akan teridentifikasi sebagai C. parapsilosis karena warna koloni yang terbentuk merah muda pucat-putih. Koloni warna merah muda pucat dan putih dibentuk oleh beberapa spesies Candida yaitu C. glabrata, C. kefyr, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. famata, C. humicola dan beberapa spesies Candida lainnya. Pada penelitian ini warna yang dihasilkan oleh Rhodotorulla rubra juga merah muda, sehingga sangat sulit untuk menetapkan spesies atau dapat terjadi kesalahan identifikasi. Terdapat kesulitan untuk membuat batasan warna, karena warna yang dibentuk kadang-kadang bukan warna tunggal tetapi gabungan warna/ polikromatik, seperti warna ungu muda kemerahan atau hijau kebiruan. Candida albicans yang sampai saat ini merupakan spesies terpenting, tumbuh pada medium CAC sebagai koloni berwarna hijau terang yang relatif mudah dibedakan dari spesies. Khamir C. alb...