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CALIAminoacidos y Proteinas_Cabrera Barrios Maria Fernanda,​ ​Erazo Tavera Juliana,​ ​obregon andres felipe​,​Salazar Trujillo _ _Miguel Angel __Universidad Santiago de Cali __Facultad de Ciencias Básicas, Programa Microbiologia. __Informe presentado al Prof. ​Omaira Vera Lizcano...

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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CALI

UNIVERSIDAD SANTIAGO DE

Aminoacidos y Proteinas  Tavera Juliana, obregon  andres felipe,S  alazar Trujillo Cabrera Barrios Maria Fernanda, Erazo Miguel Angel Universidad Santiago de Cali Facultad de Ciencias Básicas, Programa Microbiologia. Informe presentado al Prof. O  maira Vera Lizcano email: a  [email protected], j[email protected] , [email protected], [email protected]

Resumen:Este práctica tuvo como objetivo identificar aminoacidos y proteinas de forma cualitativa por medio de unas reacciones las cuales fueron:(ninhidrina,xantoproteica, biuret y coagulación de proteína);Durante la práctica se buscó la reacción de separación de aminoácidos por medio de cromatografía, utilizando alanina,ácido aspártico,leucina y una mezcla de las soluciones la cual esta no dio debido a que el papel utilizado no era el indicado, en la reacción con ninhidrina nos dio positiva para la presencia de aminoácidos y en la xantoproteica pudimos observar los colores que nos indicaron que había presencia de aminoácidos, en la prueba de biuret también dio positiva y se pudo observar la coagulación y precipitación de la albúmina. Palabras clave: desnaturalizacion, proteinas, aminoácidos, cromatografía

I.

INTRODUCCIÓN

Para realizar la caracterización y el estudio de las macromoléculas en general se realiza inicialmente un aislamiento y purificación partiendo de mezclas complejas de material biológico, es entonces la cromatografía una de las técnicas más usadas para este fin, donde se utilizan las características propias de las macromoléculas tales como solubilidad, tamaño, forma, carga, afinidad con otras moléculas para realizar la separación, propiedades las cuales se llevan a condiciones de temperatura, pH, hidrofobicidad y fuerza iónica.1

La cromatografía en papel se lleva en dos fases fase estacionaria donde se refiere a la adsorción de agua en el papel filtro y la fase móvil hace referencia a una solución que contiene uno o varios materiales disolventes donde se pone en contacto con la fase estacionaria, esta fase es donde se promueve el movimiento de distintas moléculas abandonen el papel filtro, este movimiento de separación depende de la afinidad química y las propiedades químicas, si uno de los componentes posee una alta afinidad química con la fase móvil el efecto de retención de la fase estacionaria sería nulo. Por lo cual la

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técnica se basa en la afinidad y la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos arrastrados por la fase móvil lo que nos permite identificar los componentes de la mezcla y como pueden ser separados.2 Los aminoácidos (2-amino-carboxílicos) tienen diferentes funciones en el organismo pero ante todo sirven como unidades básicas de los péptidos y de las proteínas. En el código genético solo se consideran los veinte aminoácidos proteicos; estos veinte aminoácidos son los que se encuentran regularmente en las proteínas y en algunos casos sufren modificaciones después de su incorporación a ellas (cambios postraduccionales).En los lípidos también se encuentran aminoácidos o sus derivados como unidades básicas, por ejemplo la serina en los fosfolípidos la glicina en las sales biliares. Algunos aminoácidos se desempeñan como neurotransmisores y otros son precursores de neurotransmisores, de mediadores o de hormonas.Los aminoácidos son constituyentes importantes de la nutrición (algunos son inclusive esenciales). Determinados aminoácidos forman precursores para otros metabolitos, como por ejemplo para la glucosa en la gluconeogénesis, para las bases de purinas y pirimidinas, para el hemo y para otras moléculas. Ciertos aminoácidos no proteicos funcionan como intermediarios en la síntesis y en la degradación de otros aminoácidos proteicos y en el ciclo de la urea.3 Las proteínas son las macromoléculas que realizan todas las actividades celulares; son las herramientas y у las máquinas moleculares que permiten que los eventos

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sucedan. Las proteínas, como enzimas, aceleran en gran medida las reacciones metabólicas; como cables estructurales, brindan soporte mecánico, tanto dentro de las células como en su periferia ; como hormonas, factores de crecimiento y activadores génicos, realizan una gran cantidad de funciones reguladoras;como receptores de membrana y transportadores, determinan ante qué reacciona una célula y qué tipos de sustancias entran o salen de ella; y como filamentos contráctiles y motores moleculares, constituyen la maquinaria para los movimientos biológicos. Entre sus múltiples funciones adicionales, las proteínas actúan como anticuerpos, toxinas, forman coágulos sanguíneos, absorben o refractan la luz y transportan sustancias de una parte del cuerpo a otra.4 II. METODOLOGÍA Esta práctica se dividió en 2 donde una buscamos las reacciones de los aminoácidos y en la otra las reacciones de las proteínas. Primero tomamos un trozo de papel para cromatografía y se trazó una línea con lápiz, a 2 cm del borde inferior sobre esta línea a una distancia de 2 cm de separación, colocamos 4 aplicaciones de las siguientes soluciones : alanina,ácido aspártico,leucina y una mezcla de las 3 soluciones posteriormente pasamos a secar el papel con una secadora de pelo y ya seco volvimos aplicar otro poco encima de cada una de las soluciones luego de que se secara otra vez colocamos unos clips a los lados para sostener el papel bien para que esta no tocara las paredes, se colocó el papel en el erlenmeyer donde está tenía el

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solvente y esperamos a que llegue a unos dos centímetros del borde superior;luego lo pusimos a secar para proceder a rociar ninhidrina lo dejamo a una temperatura de 110º C en la estufa, durante 5 minutos.

Reacción de Biuret:En un pusimos 3 ml de solución agregamos el mismo hidróxido de sodio 5 M, sulfato cúprico 0.1 M.

reacciones con aminoácidos

III.

ninhidrina:En 5 tubos de ensayo colocamos 0.5 ml de solución de los siguientes aminoácidos: prolina, ácido aspártico, arginina, leucina, asparagina y tirosina más 0.5 ml de ninhidrina en acetona al 1 %; luego pasamos los tubos a baño de agua hirviendo por 5 minutos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aminoácido

resultado

prolina

positivo amarillo

ácido aspártico

positivo y color azul

arginina

positivo color azul claro

leucina

positivo color azul

tirosina

positivo violeta

xantoproteica: En 4 tubos de ensayo colocamos 0.5 ml de solución de cada uno de los aminoácidos: glicina, triptófano, fenilalanina, y fenol más 0.5 ml de ácido nítrico concentrado. luego agregamos a cada tubo 2 ml de NaOH 10 M. Coagulación de una proteína:Utilizamos 7 tubos de ensayo, en cada tubo agregamos 3 ml de solución de albúmina, excepto al No 1 que lleva los 5 ml de clara de huevo donde cada tubo va a contener lo siguiente Tubo 1. clara de huevo la cual calentamos suavemente en un baño de agua controlando la temperatura, Tubo 2. se agregó 2 ml de acetona,Tubo No. 3 1 ml de HCl 9 N, Tubo 4. 2 ml de NaCl al 20 %, Tubo 5. 2 ml de HNO3 al 20% y el Tubo 6. 4 ml de NaOH 5 M, Tubo 7 Control; Para la precipitación de proteína por medio de iones metálicos pesados lo que hicimos fue depositar en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina, y añadir 1 ml de acetato de plomo 0.005 M posteriormente agregamos 1 ml de ácido etilendiaminotetracético(EDTA) 0.05 M.

tubo de ensayo de albúmina y volumen de y 5 gotas de

color

color

(tabla 1).resultados de los aminoácidos en reacción con la ninhidrina. Aminoácido

resultado

fenilalanina

color amarillo

fenol

color naranja y esta se coágulo al pasar el tiempo

glicina

color amarillo

triptófano

amarillo

(tabla 2.)resultados de los aminoácidos en la reacción xantoproteica. prueba

Rf

alanina

0,53

ácido aspártico

0,29

leucina

0,81

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mezcla de los 3

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0,78

(tabla 3.) resultado de Rf aminoácidos

de los

(imagen 3.)

(imagen 1.) los aminoácidos en reacción con la ninhidrina antes del baño maria (imagen 4.) aminoácidos reacción xantoproteica.

antes de la

(imagen 2.) aminoácidos después del baño maria

(imagen 5.) aminoácido después de la reacción xantoproteica

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papel utilizado para esta no era el de cromatografía pero pudimos sacar la Rf .

(imagen 6.)Coagulación de una proteína

(imagen 7.)Precipitación de la proteína por iones metálicos pesados

(imagen 8.) Reacción de Biuret discusión: primero en lo que fue la separación de aminoácidos por medio de cromatografía esta no nos dio ya que el

reacción de ninhidrina: en esta reacción todas nos dieron positiva porque los aminoácidos al ser libres poseen un grupo carboxilo libre adyacente al grupo amino,al reaccionar ocasiona la descarboxilación del iminoácido a dióxido de carbono al ser esta una reacción que transcurre a altas temperaturas, intervienen dos moléculas de ninhidrina por cada molécula de aminoácido produciendo la liberación de CO2 (g), NH3 formando un complejo de color violeta conocido como Púrpura de Ruhemann,la ninhidrina al reaccionar con el aminoácido este se oxida a aldehído y la ninhidrina es reducida a hidridantina;Esta última reacciona con otra molécula de ninhidrina y con el amoniaco producido en la primera reacción forman un producto coloreado azul que se observo en el acido aspartico y en la leucina.5 reacción xantoproteica:como se pudo observar en la imagen 5 la glicina, triptófano y fenilalanina se obtuvo una coloración amarilla esto se debe a la nitración del anillo bencénico tiene contacto con el ácido nítrico la cual esta a su vez reacciona con los núcleos aromáticos sustituyendo hidrógenos por radicales nitro (dióxido de nitrógeno) lo que forma nitroderivados aromáticos de color amarillo y en el caso del fenol que se formo una tonalidad anaranjado al principio pero al pasar el tiempo se coagulo y esto se debe a la adición de una base fuerte lo cual hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. coagulación y precipitación de proteína: como se puede observar en la imagen 6 se dio la coagulación de las proteínas lo cual a esta reacción se le llama desnaturalización esto se debe a que al someter la albúmina a diferentes agentes desnaturalizantes ocasionó la destrucción de la estructura secundaria y terciaria esto quiere decir que las fuerzas que

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mantenían la proteína en esta conformación como lo son puentes disulfuro, enlaces de hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas, fuerzas electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo desaparecen ya que al estar en un medio ácido y básico tiene un exceso de iones H+ y OH–. En el caso de la precipitación como se puede observar en la imagen 7 lo que ocurrió fue que los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular causan la separación de proteínas es decir a pH neutro por lo general las proteínas tienen carga neta negativa y se combinan fácilmente con iones de metales pesados que, al neutralizar la carga producen la precipitación. en la reacción de biuret lo que ocurrió fue que las cadenas de proteínas presentes en la clara de huevo cuando fueron sometidas al reactivo de Biuret, que en su composición tiene NaOH al 10% esta proporciona el medio básico necesario junto con el CuSO4, la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu+2 y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presente en la solución de albúmina de huevo reaccionan dando el color violeta que se observa en la imagen 8. IV.

CONCLUSIONES

● Al identificar de manera cualitativa aminoácidos puntuales, encontramos que debido a las reacciones características en algunos compuestos puede dar indicios de la posible estructura de los mismos, ya que, a pesar de tener grupos funcionales unitarios similares, la distribución y disposición espacial hace que su reactividad ante los diferentes ensayos sea levemente diferente.

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Son métodos rápidos, prácticos y contundentes, ya que los resultados positivos son apreciables a simple vista, lo cual reduce considerablemente la presencia de falsos positivos ● La técnica de Cromatografía de Placa es útil para la separación de diferentes tipos de aminoácidos en una mezcla de los mismos, con lo que se puede caracterizar cada uno de acuerdo a sus características estructurales de manera fácil, determinando los valores de Factor de Retención y con ayuda de reactivos relevantes, lo cual ayudará a soportar estudios iniciales de este tipo de compuestos. ● se pudo concluir que para realizar la cromatografía de papel es muy importante el tipo de papel ya que esta influye mucho a la hora de realizar el experimento.

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REFERENCIAS 1. Jesús V. Jorrín Novo, Mª Nieves Abril Díaz, José A. Bárcena Ruiz. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción con ninhidrina; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales. 2. José Peinado Peinado, Fermín Toribio Meléndez-Valdés. Cromatografía en papel de aminoácidos; Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales. 3. Jan Koolman, Klaus-Heinrich Röhm,BIOQUIMICA: TEXTO Y ATLAS (3ª ED.),Editorial Médica Panamericana, S. A,Madrid España.2004,PÁG 58. 4. Gerald Karp,Biología celular y molecular,séptima edición,Editorial McGraw-Hill.2014,PÁG 50. 5. Jean F. MacFaddin,Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica,Editorial Médica Panamericana, S. A,Madrid España.2003,PÁG 185....