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INFORME DE LABORATORIO BIOQUÍMICA SEGUNDO SEMESTRE FACULTAD DE ODONTOLOGÍA-ÁREA BIOCLINICA

AMILASA SALIVAL Estudiantes de odontología segundo semestre. Docente Bioquímica, Facultad de Odontología RESUMEN

Este laboratorio tuvo como objetivo aclarar el concepto de enzima y su importancia, esto mediante el análisis de la enzima a-amilasa presente en la saliva, por medio de pruebas cinéticas verificando así su acción enzimática en la cavidad oral simulando las condiciones de ésta en cuanto a temperatura, pH, etc...para que la acción de la enzima como biocatalizador fuese óptima. La práctica, inició con la obtención de la a-amilasa a partir de la saliva de un integrante del grupo, posteriormente se obtiene la cantidad de a-amilasa adecuada para luego realizar el seguimiento de la cinética de desaparición del almidón y la aparición de azúcares reductores Palabras clave: Biocatalizador, alfa-amilasa salival, cavidad oral. Fecha de entrega: 19/02/2019

1.

INTRODUCCIÓN

La saliva es un fluido producido por las glándulas salivales el cual es vertido por toda la cavidad bucal y desempeña distintas funciones en el mantenimiento de la salud bucal y en general del individuo. Desempeña funciones muy importantes en el mantenimiento de la salud bucal y general del individuo, entre ellas: lubricación, acción antimicrobiana, capacidad amortiguadora del pH de la cavidad bucal y la placa dental, remineralización y protección contra la desmineralización, masticación, formación del bolo alimenticio, deglución, digestión, gusto, lenguaje y mantiene la homoestasis de la cavidad oral. Este fluido es un medio perfecto para el monitoreo de la cavidad oral así como también la salud en general, debido a que está compuesta de una variedad de proteínas, enzimas, hormonas, anticuerpos, constituyentes antimicrobianos y citocinas, muchos de los cuales pasan de la sangre a la saliva, a través de sistemas de transporte intra y extracelular. [1] LAS PROTEÍNAS SALIVALES

Dentro de las funciones de la saliva se aduce a la protección de distintas proteínas salivales las cuales ayudan al buen funcionamiento de las propiedades de la saliva. Cabe resaltar que las proteínas son biomacromoléculas precursoras de los aminoácidos que se unen entre sí a través de enlaces covalentes denominados enlaces peptídicos, lo que da lugar a la cadena peptídica. Gracias a diferentes investigaciones se han podido identificar 309 proteínas en la saliva total. Más de 95% corresponde a las principales familias de proteínas que incluyen: proteínas ricas en prolina, alfa-amilasa salival, mucinas, aglutininas, cistatinas, histatinas y estaterinas. A continuación, se describe la estructura de estas y otras proteínas salivales (inmunoglobulinas, lisozima, peroxidasa salival y lactoferrina) por su importancia para la salud bucal, así como los aspectos conocidos sobre su función y mecanismo de acción.[2] LA ALFA-AMILASA SALIVAL Dentro del laboratorio se estudió específicamente el comportamiento de la enzima alfa-amilasa salival. La variabilidad en la concentración o actividad de la α-amilasa salival o la pancreática permite detectar anomalías en los órganos que la producen. La α-amilasa encontrada en la saliva humana (AASH) es la suma de la secretada por las glándulas salivales y de la secretada por el páncreas que, por mecanismos de transporte celular, entra a formar parte de la saliva. La AASH tiene múltiples funciones biológicas, como enzima cumple un papel importante en la digestión inicial del almidón, el glucógeno y otros polisacáridos, porque cataliza la hidrólisis de los enlaces α-1,4-glucosídicos, lo cual resulta en la configuración α-anómerica de los oligosacáridos. Al ser la proteína de mayor abundancia en la saliva hace parte de la película adquirida y de la placa dentobacteriana, adicionalmente, se une con alta afinidad a un selecto grupo de estreptococos orales.[2] El objetivo de este informe es exponer el comportamiento de la enzima alfa-amilasa salival al entrar en contacto con el almidón. GENERALIDADES La alfa-amilasa salival es la macromolécula de mayor concentración en la saliva y por sus propiedades y funciones enzimáticas representa

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también la enzima más importante en la saliva, su PH óptimo oscila entre 6.7 y 7.0. Esta constituye entre el 10% y el 20% del total de las proteínas de la saliva, es sintetizada y secretada por las glándulas del paladar y por células acinares que forman más del 80% de las células en las glándulas salivares mayores (parótida, submaxilar y sublingual), y de estas son las parótidas las que la sintetizan en mayor proporción. En la saliva comienza la digestión de los alimentos, especialmente de los almidones, cabe resaltar que un almidón es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, constituido por amilosa y amilopectina. Proporciona el 70-80% de las calorías consumidas por los humanos de todo el mundo. ingeridos, el almidón se digiere gracias a la actividad enzimática de esta proteína. Dicha actividad es más eficiente cuando el bolo alimenticio se mezcla, por los movimientos de la lengua, con la alfa-amilasa salival, por lo que puede causar una disminución en la percepción del grosor y en la viscosidad de los alimentos. Esta enzima aunque en menor concentración, también hace parte de otros fluidos corporales, como el plasma sanguíneo, las secreciones bronquiales y las lágrimas.[2] FUNCIONES DE LA α-AMILASA SALIVAL HUMANA Como la mayoría de las proteínas de la saliva, en el medio oral la AASH posee múltiples funciones, organizadas en tres categorías biológicas: primero, la función enzimática o la actividad hidrolítica, responsable de la degradación de los almidones en oligosacáridos, la digestión del glucógeno y otros polisacáridos (por la hidrólisis de los enlaces glucosídicos α-1,4 de los oligosacáridos, que liberan glucosa al medio ambiente oral) Segundo, la unión a la superficie del esmalte o a la hidroxiapatita. Existe suficiente evidencia que indica que la a-amilasa se une al esmalte del diente o a la hidroxiapatita) cuando se hacen pruebas in vitro. Se une al diente y forma parte constitutiva de la película adquirida al esmalte. La AASH hace parte del biofilm y, por medio de estudios de microscopia de transmisión electrónica, se ha probado que se distribuye dentro de la PA (pelicula adquirida) al azar y que se encuentra en mayor cantidad entre los 30 y 60 min del inicio de su formación. Tercero, la AASH desempeña un papel importante en la unión de las bacterias orales, ya que se une con

alta afinidad a estreptococos orales, los primeros colonizadores de la placa dentobacteriana.[2] HIDROLISIS DEL ALMIDON El almidón es un polisacárido compuesto por unidades de glucosa con dos componentes, uno mayoritario que es llamado amilosa, y otro minoritario llamado amilopectina. En la degradación del almidón por la a, amilasa salival, se forma un complejo azul con yodo, que por su parte la amilasa actúa hidrolizando los distintos enlaces que podemos encontrar en ellos. Esto quiere decir que esta Hidrólisis produce azúcares, que son previamente utilizados para muchos procesos y microorganismos, que las más comunes y más utilizadas son las Alfa y Beta amilasa. Para que esta hidrólisis sea efectiva, conviene que esté gelatinizado, por esta razón se realiza un cocimiento del almidón antes de la adición de dichas enzimas: Una vez que el almidón está transformado en glucosa, maltosa y dextrina, se introduce la levadura y se transforma en etanol. Se puede observar en el laboratorio que cuando la hidrólisis progresa los colores van cambiando, tornándose un poco más rojos y claros.[4] RELACIÓN ALFA AMILASA Y CARIES DENTAL La glucosa liberada por la acción enzimática de la AASH puede ser usada como una fuente de alimento por las bacterias que componen la placa dentobacteriana y después metabolizada por ellas mismas a ácido láctico, que finalmente es el que produce la caries . Algunos estudios han mostrado cómo la AASH adsorbida sobre la superficie de los dientes y combinada con sacarosa, almidón y glucosiltransferasas bacterianas incrementan la formación de una biopelícula en la que el microrganismo predominante es el Streptococcus mutans (S. mutans), lo que indica que la interacción huésped-patógeno-dieta modula la formación de biopelículas patogénicas relacionadas con la caries dental (37). Se ha reportado, además, que distintas bacterias tienen capacidad de unión a esta proteína. Estudios in vitro han revelado la unión de Streptococcus sanguis (38) y de S. gordonii (22,30) y de la mayoría de las cepas de este, también de la

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mayoría de las cepas de Streptococcus mitis, y de solo algunas cepas de Streptococcus anginosus y Streptococcus salivarius.[2] . LA ALFA-AMILASA Y EL ESTÍMULO SIMPÁTICO Además de ser una enzima catalizadora la alfaamilasa salival juega un papel importante en el estímulo simpático ya que actúa como biomarcador salival del estrés agudo y el estrés psicológico. Los biomarcadores o marcadores biológicos, son substancias que indican un estado biológico sea bioquímicos, fisiológicos o morfológicos. Es decir son unos indicadores que pueden medirse objetivamente, el cual nos indicaría que un proceso biológico es normal o patológico (indicativo de una enfermedad).[5] La alfa-amilasa salival se ha propuesto como un biomarcador no invasivo sensible para los cambios inducidos por el estrés en el cuerpo que reflejan la actividad del sistema nervioso simpático. Los niveles elevados de alfa amilasa salival (AAs) reflejan la actividad del sistema simpático-adrenomedular y por ello es considerado un marcador biológico del estrés psicológico. Así mismo, diversos estudios han hallado una asociación entre niveles elevados de AAs y diferentes patologías que cursan con dolor. La alfa-amilasa salival ha llamado la atención de los investigadores por su papel como biomarcador sensible para los cambios en el cuerpo relacionados con el estrés que reflejan la actividad del sistema nervioso simpático. Varios estudios que aplican protocolos de estrés psicológico han demostrado que la alfa-amilasa salival es altamente sensible a los cambios relacionados con el estrés. Se ha observado un aumento en la concentración de AAs en sujetos bajo condiciones académicas de estrés. También se ha informado un aumento significativo en el AAs en condiciones tales como durante la preparación para el paracaidismo, utilizando videojuegos estresantes, durante la tarea de cálculo mental estimulando la conducción etc. También se han investigado los perfiles diurnos de AAs y cortisol salival en bailarines de salón de diferentes edades y sexos Además del estrés psicológico, también se ha observado un aumento del AAs en varios estudios durante y después del ejercicio físico.[3] .

2.

MATERIALES Y MÉTODO

Los materiales que se utilizaron para llevar a cabo la práctica de laboratorio son: 1 Gradilla 12 Tubos de ensayo Pipetas de 1, 5 y 10 ml graduadas Pipeteador 1 Vaso de precipitado de 50 ml

Baño termostático (37ºC) Pinzas para tubo de ensayo Termostato Almidón al 0,25%, hervido

papel filtro Beaker de 250 ml Beaker de 100 ml Erlenmeyer de 100ml Solución de lugol (10 ml de Slc de gram Baño termostático (37ºC) en 490 ml de agua destilada) Suero fisiológico Reactivo de Benedict Embudo NaCL 0.9 %

El procedimiento se llevó a cabo, mediante 3 etapas. La primera etapa consiste en obtener la enzima aamilasa salival. 1. En un beaker de 100 ml colocar un embudo y un papel de filtro humedecido con suero fisiológico. 2. Depositar 2 mil de saliva en el embudo y añadir 12 ml de suero fisiológico (H2O+ NaCl ) 3. Dejar en reposo hasta obtener el filtrado homogéneo. La segunda etapa consiste en la obtención de amilasa salival adecuada 1. Marcar 5 tubos de la A a la E y pipetear cantidades específicas Reactivo Almidón 37ºC Suero fisiológico a-amilasa

A 5

B 5

C 5

D 5

E 5

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.1

0.2

0.4

0.5

0.3

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2. Añadir la amilasa rápidamente y agitar rápidamente hasta obtener una mezcla homogénea

precipitación de azúcares reductores, de una coloración verde agua marino.

4. 3. Incubar 5 min a 37ºC desde el momento en que se adiciona y agita la enzima 4.

Pasado el tiempo, añadir 1 ml de disolución de yodo y observar la aparición de color.

5. Identificar el que menor coloración posee. Y en la tercera fase tenemos el seguimiento de la cinética de desaparición del almidón y la aparición de azúcares reductores. 1. Utilizar 6 tubos de 1 ml con disolución de yodo y otros 2 tubos con reactivo de benedict 2. Pipetear a parte 10 ml de almidón y someterlo a 37ºC de temp. 3. Al finalizar el tiempo de agregar el doble de a-amilasa salival 4. Mezclar rápidamente y pipetear. 5. Pipetear 1 ml de la solución a un tubo con yodo y a uno de los tubos con el reactivo Benedict 6. Pasado 5 min agregar 1 ml de la mezcla a el otro tubo de benedict 7. Colocar los 2 tubos de reacción benedict a 100ºC durante 5 min y observar resultados.

3.

DISCUSIÓN (O ANÁLISIS DE RESULTADOS)

La reacción de la a-amilasa sobre el almidón (Ver figura 1.), tiene que darse debido a que los seres humanos tienen reserva energética en estos en forma de glucógeno, el cual tiene que transformarse en azúcares reductores quienes nos proveen la energía necesaria para realizar las diferentes funciones del cuerpo. Lo anterior se evidenció en los resultados arrojados en la práctica, los cuales indican que el proceso de reacción de la enzima está regulado también por otros factores como pH, temperatura, etc… Y hablamos de temperatura debido a un fallo experimental en la práctica donde los tubos de benedict tuvieron que ser re evaluados luego de haber terminado su ciclo, por falla en los °C a los que tenían que ser atemperados primeramente. Es decir, los resultado anexos en caso de los tubos Bennedict fueron los consecuentes de 2 procesos; sin embargo se tuvo en cuenta el último resultado ya que éste arrojaba lo necesario para comprender y lograr el objetivo de la práctica.

RESULTADOS

De los resultados arrojados en la práctica se puede observar que los tubos de mezcla de almidón y amilasa salival luego se someterse 5 min a 37°, obtuvieron colores diferentes. El tubo denominado A fue uno de los más pigmentados, tornándose de color azul oscuro, seguido estaba el tubo B y el C, disminuyendo gradualmente su coloración. Los tubos D y E fueron los tubos con menos intensidad en el color, siendo el tubo E el que logró mayor actividad enzimática, esto se evidencia por su escasa presencia de color en la solución. En cuanto a los tubos de 3 ml que contenían el reactivo benedict podemos observar una

FIGURA 1. Reacción de la a-amilasa, con el glucógeno para la formación de productos tales como Maltosa, Maltritiosa, y a-Dextrins las cuales son azúcares simples o reductores. CONCLUSIÓN Es fundamental en su papel dentro de las funciones de la saliva como en el caso del cuidado y sostenimiento de la salud bucal. También mantiene el pH neutro, a causa de que, neutraliza los ácidos producidos tras la comida y evita la desmineralización del esmalte protegiéndolo contra la caries y acumulación de la placa bacteriana.

5.

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En el experimento podemos concluir que en los tubos de benedict se observa una leve una leve precipitación de monosacáridos o azucares reductores. Mientras que en el tubo de tiempo 1 (número dos) y en el de tiempo 5 (número 6) es que este tuvo mayor actividad enzimática que en el otro tubo debido a la duración del proceso metabólico. Por otra parte en la obtención de la cantidad de aamilasa adecuada el tubo que se tornaba más claro era el que presentaba mayor actividad enzimática

6.

¿QUÉ APRENDIMOS?

En este laboratorio, que tiene como tema principal la amilasa salival pudimos entender a fondo la importancia de las enzimas y su función en el cuerpo, ya que trabaja como biocatalizador. Por otra parte, profundizamos acerca de la a-amilasa salival, que es una de las hidrolasas más relacionadas con la odontología, dado que ayuda a la limpieza bacteriana de nuestra cavidad oral pues “...desempeña un papel importante en la colonización y metabolismo de las bacterias que conducen a la formación de la placa. En solución, esta proteína se une con gran afinidad a un selecto grupo de estreptococos orales, lo cual puede ayudar en la depuración o limpieza bacteriana de la cavidad oral”. Lamby CP, Gómez OL, Jaramillo L. La α-amilasa salival: relación con la caries dental y la salud en general.

7.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Artículos: [1]Bárbara E. García Triana, Principales proteínas salivales: estructura, función y mecanismos de acción. Universidad de Ciencias Médicas de La Habana. Facultad de Estomatología "Raúl González Sánchez" [2]Lamby CP, Gómez OL, Jaramillo L. La α-amilasa salival: relación con la caries dental y la salud en general. Univ Odontol. 2013 Jul-Dic 32(69): 93-101. [3]Sahu, GK, Upadhyay, S., y Panna, SM (2013). Actividad de alfa amilasa salival en seres humanos de diferentes grupos de edad sometidos a estrés psicológico. Revista india de bioquímica clínica: IJCB , 29 (4), 485-90.

Referencias de internet: [4] https://www.ecured.cu/Almid%C3%B3n [5]https://robertcabre.com/2012/05/18/que-son-yque-funcion-tienen-los-biomarcadores-en-elorganismo/ FIGURA 1 Tomada de: https://sociedaddemente.wordpress.com/tag/amilas a/...