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La amilasa salival es una enzima digestiva presente en la boca cuya función es el rompimiento hidrolítico de los enlaces glicosídicos alfa -1,4 de la amilosa y la amilopectina presente en el almidón. Se tomó amilasa salival para evaluar la actividad catalítica sobre diferentes parámetros como la tem...

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ESTUDIO DEL EFECTO DE FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA AMILASA SALIVAL (TEMPERATURA, pH, CONCENTRACION DE ENZIMA, IONES METALICOS Y CONCENTRACION DE SUSTRATO) Acosta T1, Rivera A1 y Sarchy, S 1 1

. Estudiante del programa de Química, Universidad de Nariño, Pasto (Colombia).

Resumen La amilasa salival es una enzima digestiva presente en la boca cuya función es el rompimiento hidrolítico de los enlaces glicosídicos alfa -1,4 de la amilosa y la amilopectina presente en el almidón. Se tomó amilasa salival para evaluar la actividad catalítica sobre diferentes parámetros como la temperatura, pH, concentración del sustrato, enzima y el efecto de los iones metálicos sobre esta. Al realizar los diferentes análisis se encontró que a temperatura de 40 °C la enzima presenta un funcionamiento óptimo; con respecto al pH la enzima tubo un buen funcionamiento a pH 7.0; al aumentar la concentración de la enzima mayor fue el porcentaje de reacción, con la concentración del sustrato sucedió que hasta que la encima se saturo y por ultimo con los iones metálicos se observó que hay mayor efecto de la acción de la amilasa con el ion de mercurio debido a que este afecta la estabilidad de la conformación de la encima con actividad catalítica; además se obtuvo una Vmáx de 4.528 x 10−3 % Almidon / s y un Km 0.02459 %. De esta manera se deduce que este estudio no es muy exacto a la hora de determinar el porcentaje de reacción debido a que es una prueba más cualitativa que cuantitativa; además hay factores que afectan la medición pues la concentración con la cual se trabajo es de saliva y no propiamente de amilasa salival. Palabras claves: Amilasa salival, pH óptimo, temperatura óptima, enzima, sustrato, almidón. Introducción Las enzimas son macromoléculas proteínicas cuya función es catalizar reacciones químicas, realizando un cambio químico específico sobre el sustrato sobre el que actúan [1]. En este estudio se trabajó con saliva fluido biológico de gran importancia debido a que está compuesta de una variedad de proteínas, enzimas, anticuerpos, constituyentes antimicrobianos y citosinas [2], muchos de los cuales pasan de la sangre a la saliva, a través de sistemas de transporte intra y extracelular [3].

Dentro del contenido proteico de la saliva, el componente de mayor concentración es la α-amilasa, la cual es secretada por el páncreas y por glándulas salivales, ambas de carácter enzimático [4]. En este trabajo de estudio se evidencio que la actividad catalítica de la α-amilasa se ve afectada por varios factores, uno de ellos es variación de pH, un cambio en este transforma la forma y estructura de la misma enzima [5], debido a que el pH al cual las enzimas adquieren su máxima actividad es diferente para cada una de ellas y depende de la secuencia de aminoácidos que las conforman, por lo que si se ve afectada su conformación también se afecta su actividad catalítica [6]. A pH extremos se da la desnaturalización de las enzimas, debido a modificaciones en las interacciones iónicas que intervienen en la estabilidad de la enzima en su estado nativo [7]. Otro factor que afecta la actividad catalítica es la concentración del sustrato básicamente existe una relación lineal es decir al aumentar el sustrato la velocidad aumenta, esto es debido a que existe una cierta cantidad de enzima libre [8]. Además, la actividad catalítica es afectada por influencia de la temperatura ya que un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiado, la enzima pierde su actividad [9]; por otra parte, la concentración de la enzima influye siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite [10]. Estudios afirman que existen dos tipos de cofactores enzimáticos: los iones metálicos y las coenzimas, pero el cofactor en que se enfocó este trabajo fue en los iones metálicos; estos son generalmente cationes monos o divalentes [11]. Según investigadores estos actúan de varias maneras: 1) En algunos enzimas el ion metálico constituye el verdadero centro catalítico; en estos casos el ion suele presentar por sí solo una cierta actividad catalítica, que se ve incrementada cuando forma parte del enzima. 2) En otros enzimas el ion metálico constituye un grupo puente para unir el sustrato al centro activo [11].

3) A veces el ion metálico no forma parte del centro activo, sino que se encuentra en un lugar del enzima muy alejado del mismo, actuando como agente estabilizador de la conformación nativa del enzima. En el presente trabajo se estudiarán los factores que afectan la actividad enzimática de la amilasa salival, y como estos influyen en la determinación de la velocidad máxima y su afinidad. [12].

Figura 1: composición del almidón amilasa y amilopectina. Metodología Se recogió 60 mL de amilasa salival, se rotularon 4 tubos con los siguientes valores 0, 20, 40 y 90 añadiéndose a cada uno 1 mL de almidón. El tubo 0 se colocó en baño de hielo, el de 20 a temperatura ambiente, el de 40 y 90 en baño de agua a temperatura de 40°C dejándose estos por aproximadamente 10 minutos, pasado el tiempo requerido se agregó a los tubos de ensayo 0,5 mL de amilasa salival que se dejó actuar por 20 segundos y seguidamente se tomó una cierta cantidad la cual se adiciono a una placa de porcelana con lugol con el fin de observar un color amarillo que indico que la temperatura optima es de 40 °C. Además, para determinar el pH optimo al cual se debía trabajar se marcaron 5 tubos con los siguientes valores 3, 5,6,7 y 9 que fueron depositados en un baño de agua a 40°C (temperatura optima) y se

agregaron a cada uno las sustancias en el orden que muestra en la tabla 1. Tabla1. Mezcla de sustancias para determinar el pH óptimo. Tubo Almidón 0,5% Amortiguador pH 3.0 Amortiguador pH 5.0 Amortiguador pH 7.0 Amortiguador pH 9.0 Amilasa salival

3 1 mL 2 mL

5 1 mL

6 1 mL

7 1 mL

9 1 mL

2 mL 2 mL 2 mL 0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

0,5 mL

Después de que los tubos obtuvieron la temperatura adecuada se adiciono por último la amilasa salival, la cual se dejó reaccionar por aproximadamente 1 minuto, pasado este tiempo se añadió tres gotas de esta sustancia a la placa de porcelana con lugol, donde se observó el color amarillo a pH 7 lo cual indico que es el valor optimo a trabajar. Posteriormente se rotularon 5 tubos a los cuales se adiciono las sustancias mostradas en la tabla 2, estos tubos se sometieron a un baño de 40 °C. Tabla 2. Mezcla de sustancias para determinar concentración optima de enzima Tubo Almidón 0,5% Amortiguador pH 7.0 Amilasa salival

1 2 mL 2,9 mL 0,1 mL

2 2 mL 2,7 mL 0,3 mL

3 2 mL 2,1 mL 0,9 mL

4 2 mL 1,2 mL 1,8 mL

Una vez que los tubos adquirieron la temperatura de 40 °C se adiciono la amilasa salival dejando actuar por 1 minuto para después tomar tres gotas y depositarlas en la placa con lugol donde se encontró que la

concentración optima de enzima fue la que se añadió 1.8 mL solución de amilasa salival.

de

También, se estudió el efecto de los iones metálicos sobre la acción de la amilasa, en la cual se tomaron iones y sustancias contenidas en la tabla 3. Tabla 3. Mezcla de sustancias para estudio de efecto de iones metálicos sobre la amilasa Tubo

Cont rol Almidón 0,5% 2 mL Amortiguador pH 3 mL 8.0 HgCl2 0,5% NO ¿ 0,5% Pb¿ ¿ NO ¿ 0,5% Cu¿ ¿ Amilasa salival 1 mL

+¿ ¿ Hg

+¿ ¿ Pb

+¿ ¿ Cu

2 mL 2 mL

2 mL 2 mL

2 mL 2 mL

1 mL 1 mL

2 mL

1 mL

1 mL

1 mL

Como se dijo anteriormente la amilasa salival se la agrego cuando los tubos alcanzaron la temperatura óptima y posteriormente se añadió esta sustancia a la placa con lugol donde se determinó que el ion de mercurio Hg2+ tuvo la mayor acción de inhibición sobre la amilasa. Por último, se marcaron cinco tubos de ensayos a los cuales se les adiciono las sustancias mostradas en la tabla 4, estos tubos se sometieron a un baño de agua de 40 °C. Tabla 4. Mezcla de sustancias para estudio del efecto de concentración de sustrato Tubo Almidón 0,5%

0,25 0,5 mL Amortiguador pH 8,5 8.0 mL Amilasa salival 1 mL

0,5 1,0 2,0 1 mL 2,0 4,0 mL mL 8,0 7,0 5,0 mL mL mL 1 mL 1 mL 1 mL

4,0 8,0 mL 1,0 mL 1 mL

la

Después de alcanzar la temperatura óptima al tubo 0,25 se le añadió la amilasa salival, se agito y pasado 15 segundos se extrajo dos gotas de esta solución para la realización de la prueba con lugol para obtener el color rojo pardo, de manera similar se repitió el procedimiento para cada uno de los tubos de ensayo. Resultados Tabla 5: Resultados de las pruebas realizadas para la determinación de la influencia de diferentes factores. Prueba

Resultados enzimática 40 oC 7 1.8mL

de

actividad

Influencia de la temperatura Influencia del pH Concentración óptima de enzima Efecto de los iones metálicos Hg2+ sobre la acción de la amilasa En las pruebas realizadas se determinó que en las diferentes temperaturas que se sometió la encima α amilasa 0 oC, 20 oC, 40 oC y 90 o C la temperatura óptima para la catálisis fue a 40 oC. En el caso del pH óptimo se determinó que es a 7. El volumen de enzima que presento mayor efecto catalizador fue el de mayor volumen de 1.8 mL. Para la prueba con iones metálicos entre Cu+2, Pb+2 y Hg2+ el ion de mercurio inhibió la encima con mayor eficiencia.

Figura 2: Pruebas de la influencia de iones metálicos y

prueba para la determinación de la concentración de amilasa para una catálisis óptima. Los resultados de la inhibición de la amilasa con los metales Cu +2, Pb+2 y Hg2+, corresponden a la imagen izquierda anterior, en la que tiene mayor coloración azul para el ion de mercurio Hg 2+, lo que indica que es el que inhibió con mayor eficiencia la encima. La imagen a la derecha corresponde la prueba de la determinación de concentración de encima en la que se observa que al que se le añadió 1.8 mL de encima tiene el color amarillo intenso indicando (columna #4 en la placa de porcelana) mayor eficiencia en la catálisis del almidón al transformarlo en glucosa. Tabla 6: volúmenes de sustrato y tiempos de reacción en la actividad catalítica de la α-amilasa y almidon.

La

Volumen de sustrato (mL)

Concentración del Sustrato [S] (%)

Tiempo t (seg)

Velocidad V= [S]/t

1/[S]

1/v

0,5 1 2

0.025 0.05 0.1

10 20 30

0.0025 0.0025 0.00333

40 20 10

400 400 300

4 8

0.2 0.4

50 70

0.004 0.005714

5 2.5

250 175

cinética de reacción se determinó al colocar diferentes volúmenes de almidón a una cantidad de solución de α-amilasa y lugol. El tiempo en segundos corresponde al tiempo en la encima α-amilasa hidroliza todo el almidón. La concentración de almidón está dada en % de almidón, que se partió de una solución de almidón al 0.5%. Con los valores del inverso de concentración de almidón y velocidad se realizó la gráfica de la figura 3 para determinar K m y V max . Figura 3: Grafica de velocidad en función de la concentración de sustrato (almidón)

velocidad vs concentracion de sustrato(%) Velocidad [S] /t (%/seg)

0.01 0.01 0 0 0 0 0

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

[S] (%)

Nota; En esta grafica los valores de velocidad se determinaron teniendo en cuenta la concentración de almidón añadido en cada prueba y el tiempo en el que el color amarillo ocre aparecía, la velocidad está dada en términos % de almidón /segundos, la concentración de sustrato esta dado en % de almidón.

Figura 4: Grafica 1/V en función de 1/ [S]

1/v vs 1/[S] 450 400

f(x) = 5.43 x + 220.83 R² = 0.72

350

1/v(1/seg)

300 250 200 150 100 50 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1/[S] (1/sustrato(%))

Nota; De gráfica de 1/v en función de 1/concentración de almidón, mediante liberalización se obtiene que la ecuación de la recta es y=5.4301x+220.83

Mediante la linealización de Lineweaver-Burk ,de la gráfica de 1/v en función de 1/concentración de sustrato, se obtuvo que la ecuación de la recta es y=5.4301x+220.83 con la que se calcula los valores de velocidad máxima y Km. Del intercepto se obtiene: 1

=220.83

V max V max =

1 =4.528 x 10−3 %Almidon / segundo 220.83

Extrapolando y=0 se obtiene

Km

y=5.4301 X +220.83 0=5.4301 X +220.83 X=

−1 −220.83 1 =0.02459 = =−40.67 → K m = 40.67 K m 5.4301

%

Discusión Se determinó que la temperatura optima a la cual tiene buen funcionamiento la amilasa fue a 40°C debido a que a este valor apareció el color amarillo ocre, presentándose en el resto de soluciones un color azul, este color se debe a la formación de complejos coloreados de la amilasa que no fue hidrolizada por la α-amilasa con el yodo; la obtención de estas soluciones coloridas al reaccionar con el reactivo de lugol (yodo) se debe principalmente a la formación de un complejo de coordinación del entre las micelas del almidón y el yodo. Estas micelas están formadas por cadenas de polisacáridos enrolladas en hélice por lo que el yodo se puede colocar centralmente en estas hélices, por ende, el color depende del largo de la sección lineal de la molécula del almidón[12].. Es por eso que la amilasa, que es una fracción lineal del almidón dará, con el yodo color más intenso de un azul profundo. En pocas palabras la amilasa se combina mucho más con el yodo ya que las moléculas de yodo están atrapadas dentro de la hélice no ramificada de unidades de glucosa de la cadena de amilasa para formar un compuesto azul. A temperatura de 0°C y 90°C al ser temperaturas extremas las enzimas y en particular la amilasa disminuye su acción y se inhiben totalmente debido a la desnaturalización de la molécula proteica, de la cual están conformadas las enzimas [13]. A temperaturas cercanas a la temperatura ambiental y corporal las enzimas presentan su mejor funcionamiento, es decir, se encuentran en un rango óptimo de temperaturas. Esto es de esperarse, ya que cada enzima tiene un rango de temperatura óptima y, en el caso de la amilasa, al encontrarse ésta en el cuerpo humano y animales (que siempre tienen una temperatura de 37° C) [14]. se obtuvo una temperatura optima de 40 °C, además se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero sí disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores. Sin embargo, al disminuir demasiado la temperatura, los choques entre las moléculas disminuyen también, por lo que la actividad enzimática baja hasta el punto en el que no se puede ver en este estudio. Por el contrario, al aumentar la temperatura a 90° C, los choques entre las

moléculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar. Con respecto al pH la enzima tuvo un funcionamiento a pH 7.0. El efecto de este sobre la velocidad de reacción enzimática es de suma importancia considerar que la mayoría de las enzimas son sensibles a este factor y hay que tener en cuenta que hay escalas específicas en el que detecta su actividad, Zeng and Cohen lograron determinar que a pH de 6.5 la α amilasa la máxima actividad enzimática debido a que a este pH las interacciones débiles de la conformación con actividad enzimática son estabilizadas [15]. El pH provoca la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo puentes de hidrogeno y enlaces iónicos, por lo que en las diversas reacciones realizadas en este trabajo se pudo apreciar los distintos cambios de colores, resultado del efecto del pH sobre estos. La función de la amilasa es hidrolizar los enlaces glucosidicos del tipo alfa 1,4 de la fracción amilosa de la molécula de almidón. La cual actúa desdoblando el almidón hasta alfa dextrinas, y luego estas hasta maltosa (aunque predominan las alfa dextrinas). Para la determinación de la concentración óptima de enzima se obtuvo que al añadir 1,8 mL que fue al máximo volumen de amilasa salival que se añadió, el color permanecía en un color amarillo acre. Este resultado es acorde a lo esperado ya que al haber gran cantidad de enzima el almidón se hidrolizara más fácil, dando lugar a la formación de azucares más sencillos y la solución adquiere una apariencia amarillenta.[16] Es decir, a mayor concentración de enzimas, mayor actividad, por ende si se trabaja con concentraciones bajas, habrá menos moléculas de amilasa salival que degrade el almidón, por ende los ensayos de las muestras con 0,1 y 0,3 mL de enzima no presentan cambios físicos notables dando a entender que se da una actividad enzimática muy baja, en el ensayo con 0,9 mL se aprecia con mayor intensidad la hidrolizacion del almidón sin embargo la concentración optima de amilasa salival se presentó al agregar 1,8 mL de la enzima. En la inhibición de la enzima α amilasa el metal que inhibió con mayor capacidad a la enzima fue el ion de mercurio Hg2+, estudios realizados han demostrado que esto depende de los residuos de cisteína que la encima tiene. Pandey y Díaz determinaron que independiente del origen de la encima la inhibición es la misma [17] [18]... Tatara obtuvo que la

inhibición de los iones metálicos como Cu+2, Pb+2 y Hg2+ se debe a las interacciones con los residuos de cisteína de la α amilasa [19]. El grupo tiol actúa como ligante de los metales, al tener pares electrónicos libres formando quelatos. En el caso del ion mercurio tiene mayor afinidad al azufre, dando interacciones termodinámicamente estables con el metal, e impidiendo que se lleve a cabo la hidrolisis de los polisacáridos [16]. En el caso de los iones de cobre y plomo también se llevó a cabo la inhibición pero la coloración azul es menos intensa. Esta inhibición también se debe a plegamiento que tiene la estructura de la α amilasa está conformada por dominios con una cavidad que tiene residuos de histidina, ácido aspartido, acido glutámico los cuales están estabilizados por el ion de Ca+2. Esta interacciones estabilizan la conformación de la encima permitiendo que el sustrato se una al sitio activo [19]. Estudios al respecto demuestran que los iones Cu+2, Pb+2 y Hg2+ pueden sustituir al ion de calcio afectando la conformación de la encima con actividad enzimática [20] [21]. Para la prueba de cinética enzimática se determinó que la velocidad máxima( V max ¿ es de 4.528 x 10−3 %Almidon / segund o, comparado este valor con los obtenidos por Alves, Montalbetti de 8.51x −3 [22] V max este muy alejado. El valor de la 10 %Almidon / segund o corresponde a la velocidad más alta a la que la encima puede hidrolizar los polisacáridos del almidón la amilosa y amilopectina lo que indica que en esta velocidad todas las moléculas de encima tiene ocupado su sitio activo por amilosa y amilopectina[23] .En el caso del K m que se obtuvo es dé 0.02459 %almidón en relación a los obtenidos similares es de 0.1712% almidón[24] . Este valor de porcentaje de almidón indica que a esta concentración de almidón ( 0.02459 % ) la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima y está relacionado con la afinidad de la encima por el almidón [25]. Conclusiones Se determinó que el pH con mayor actividad catalítica es a 7, pH en la que permite la estabilidad de la conformación con actividad catalítica de la α amilasa. A pH mayores la encima se puede desnaturalizar. También la temperatura óptima para la catálisis fue a ...