Kolokwium I diagnostyka drobnoustrojów PDF

Preview

Summary

Download Kolokwium I diagnostyka drobnoustrojów PDF

Description

Diagnostyka drobnoustrojów-część bakteriologiczna. KOLOKWIUM I ZNAJOMOŚĆ PODSTAWOWYCH METOD SŁUŻĄCYCH DO IDENTYFIKACJI BAKTERII (BARWIENIE GRAMA, OBECNOŚĆ KATALAZY, OKSYDAZY, HEMOLIZYN, WYSIEW NA PODŁOŻE HUGHLEIFSONA)

Barwienie Grama-podstawowa metoda identyfikacji (charakterystyka morfologiczna) Metoda Grama polega na zabarwieniu utrwalonych komórek zasadowym barwnikiem — fioletem krystalicznym. Następnie działa się roztworem jodu. Jod tworzy z fioletem krystalicznym kompleks, który jest nierozpuszczalny w wodzie i słabo rozpuszczalny w alkoholu oraz acetonie. Następnie komórki „różnicuje" się działając na nie alkoholem: komórki gramdodatnie zatrzymują kompleks barwnika z jodem, podczas gdy gramujemne zostają odbarwione przez alkohol. Aby je uwidocznić, stosuje się barwnik kontrastowy, np. fuksynę. Podczas obserwacji mikroskopowej bakterie gram+ widziane są jako fioletowe np. Bacillus sp., Enterococcus, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus a gram- jako różowe np. E.coli, Pseudomonas fluorescens,

Obecność katalazy Zdolność tworzenia katalazy posiada większość org. Tlenowych i względnie beztlenowych. Enzym ten jest niezbędny do rozkładu nadtlenków powstających w procesie oddychania. Bardzo ścisłe beztlenowce nie tworzą katalazy

Badanie przeprowadza się na szkiełku przedmiotowym-do dużej kropli wody utlenionej wprowadza się oczkiem ezy badaną kulturę i miesza dokładnie. W obecności katalazy tworzą się widoczne gołym okiem pęcherzyki gazu O2. Przykładami katalazo+ bakterii są: Micrococcus, Staphylococcus, Escherichia, Pseudomonas, Bacillus sp. KATALAZO-! Enterococcus, Streptococcus Rodzaj Streptococcus nie wytwarza KATALAZY co odróżnia je od gronkowców

Obecność oksydazy Oksydaza cytochromowa sanowi charakterystyczny układ enzymatyczny drobnoustrojów typowo tlenowych. Wytwarzanie jej jest cechą identyfikacyjną w różnicowaniu gram- pałeczek. Na płytce lub szkiełku przedmiotowym umieszcza się kawałek bibuły filtracyjnej i zwilża się ją kilkoma kroplami świeżo przygotowanego odczynnika (1% roztworu tetrametylo-p-fenylodiiaminy) Z 24h kultury bulionowej badanych komórek pobiera się oczkiem ezy nieco materiału i wykonuje się rysę na bibule.

Pojawienie się stałego zabarwienia po czasie dłuższym niż 1 min, uważa się za wynik negatywny. Test pozytywny: Cytochrom c(zredukowany)+O2-cytochrom c (utleniony) i H2O Cytochrom c (utleniony)+odczynnik na oksydazę-cytochrom(utleniony+odczynnik na oksydazę (fioletowy) Pseudomonas aeruginosa Test negatywny E.coli

Obecność hemolizyn Większość bakterii potencjalnie chorobotwórczych wytwarza hemolizyny, rozpuszczające czerwone krwinki. Badania hemolizy przeprowadza się na bulionie z agarem i dodatkiem 5% odwłóknionej krwi (można też użyć krwi konserwowanej z kwasem szczawiowym) Badany szczep bakteryjny posiewa się metodą rysową na powierzchni zastygłego podłoża z krwią i inkubuje przez 1-2 dni w temp. 37C. W zależności od intensywności działania hemolizyn i ich charakteru rozróżnia się 3 typy hemolizy: Hemoliza α wokół kolonii tworzy się strefa zielonkawa (hemoliza zieleniejąca) lub brunatna , w której krwinki są częściowo rozpuszczone. (H2O2 utlenia oksyhemoglobinę w methemoglobinę np. Eterococcus feacalis, Streptococcus pneumoniae Hemoliza ϐ wokół kolonii występuje wyraźnie odcinająca się strefa kompletnego rozpuszczenia krwinek(produkcja enzymów rozkładających erytrocyty np. streptolizyny Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes gr. A (paciorkowce ropotwórcze) Streptococcus gr. B (.agalactiae paciorkowce ropotwórcze) Streptococcus gr. C (S.dysagalatiae paciorkowce ropotwórcze) Streptococcus gr. G,F (S.cunis paciorkowce ropotwórcze) Hemoliza γ brak widocznych zmian w podłożu Lactococcus lactis, Streptococcus mutans

Wysiew na podłoże Hugh-Leifsona (podłoże z glukozą, można zbadać czy bakterie oddychają tlenowo, czy beztlenowo, utlenienie, czy fermentacja. Typowe tlenowce, w górnej warstwie pożywki, tlenowce na całej długości słupka) Określanie zdolności utleniania lub fermentowania cukrów-test (OF) Charakter rozkładu cukrów (oksydatywny lub fermentowany) bada się na półpłynnym podłożu agarowym Hugh-Leifosona. Z badanej kultury wykonuje się posiew kłuty do 2 równoległych probówek z podłożem, po czym w 1 z nich nawarstwia się (na wysokości ok. 1 cm) jałowy olej parafinowy, celem stworzenia warunków beztlenowych. Wysiewy inkubuje się w optymalenej temp. Przez 18-24h.

W wyniku rozkładu cukru następuje zakwaszenie i zmiana barwy podłoża na żółtą. Bakterie fermentujące cukry powodują zmianę barwy całego podłoża w obydwu hodowlach (Escherichia) natomiast bakterie utleniające cukry-tylko w górnej warstwie podłoża w hodowli tlenowej (Micrococcus, Pseudomonas) Bakterie nie rozkładające glukozy np. Alcaligenes nie zmieniają barwy podłoża w 2 probówkach Test OF jest używany do określenie czy bakterie są typowymi tlenowcami czy też względnymi beztlenowcami. Dodatkowo pozwala na rozróżnienie gram- pałeczek tlenowych od Pseudomonas aeruginosa od gram- pałeczek względnie beztlenowych E.coli, a także gram+ ziarniaków tlenowych Micrococcus od gram+ ziarniaków względnie beztlenowych (Staphylococcus aureus) BRAK REAKCJI

Glukoza——>glukoza z olejem glukoza——-> glukoza (otwarta probówka bez oleju) np. Alcaligenes feacalis

FERMENTACJA TLENOWA

glukoza——> kwasy. pH zmniejsza się z olejem

Aneoroby fakultatywne

glukoza——>kwasy, pH zmniejsza się otwarta probówka bez oleju, np. E.coli

Utlenianie

glukoza——>glukoza z olejem glukoza—->kwas z pH zmniejsza się otwarta probówka bez oleju np. Pseudomonas aeroginosa

RÓŻNICOWANIE RODZAJÓW STREPTOCOCCUS, STAPHYLOCOCCUS I ENTEROCOCCUS (CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA, HODOWLA NA PODŁOŻU Z KRWIĄ, PODŁOŻU Z ESKULINĄ, PODŁOŻU CHAPMANA, BADANIE OBECNOŚCI KATALAZY) Cecha

Staphylococcus

Charakterystyka Kom. Gronkowców są morfologiczna gram+, w starych hodowlach barwią się nieregularnie. Nieruchliwe. Charakterystyczny układ gron obserwowany jest w preparatach wykonywanych z hodowli na pożywkach stałych, spotykane są także mniejsze układy złożone z 2-4 kom, a czasami z hodowli płynach-krótkie łańcuszki. Gronkowce są w większości względnymi beztlenowcami.

Streptococcus

Enterococcus

Ziarniaki barwiące się gram+. W starszych hodowlach komórki mogą ulegać odbarwieniu. Na płynnych podłożach tworzą łańcuszki komórek lub dwoinek, nieraz znacznej długości

gram+ nieco owalne duże ziaronkowce. W preparatach tworzą pary, łańcuszki lub nieregularne skupiska. Są względnie beztlenowe, wyrastają na pożywkach prostych w temp. Od 10C do 45C w ciągu 18-24h. Na pożywkach płynnych tworzą zmętnienie.

Hodowla na agarze z krwią

Na agarze z krwią wokół kolonii szczepów niektórych gatunków (S.aureus, S.haemolyticus, S.lugdenesis, S.cohnii) pojawia się różnej wielkości strefa hemolizy typu B, zwykle lepiej widoczna po 48h lub po hodowli w atmosferze CO2

Hodowla na podłożu z eskuliną (BEA)

Dobry wzrost, ale brak czarnego zabarwienia

Hodowla na podłożu Chapmana

Szczepy Staphylococcus aureus wytwarzają własny barwnik. Po 24-24 godzinach, w wyniku fermentacji mannitolu, kolonie otoczone są żółtym halo. Szczepy Staphylococcus epidermidis oraz mikrokoki rosną w postaci małych kolonii, w większości przypadków nie zmieniających barwy podłoża. Jednakże, istotna mniejszość szczepów S.epidermidis jest zdolna do fermentacji mannitolu. Staphylococcus aureus Kolonie żółte Staphylococcus saprophyticus Kolonie żółte Staphylococcus epidermidis Kolonie różowe

Badanie na obecność katalazy

Wytwarzają katalazę

Tworzą otoczone strefą hemolizy kolonie: bardzo drobne np. S.pyogenes, niektóre paciorkowce jamy ustnej) lub większe (1mm) z dużą strefą hemolizy (S.equisimilis), czy też płaskie (2mm) z bardzo małym rąbkiem hemolizy (S.agalactiae) albo szare, czasem z pępkowatym wgłębieniem na środku (S.pneumoniae).

Nie potrafi rozkładać eskuliny-brak zaczernienia i brak wzrostu.

Niektóre rzadko spotykane szczepy mogą powodować hemolize α lub B, zwykle jednak nie hemolizują krwinek (hemoliza γ)

Rozkład eskuliny do eskuletyny i glukozy, łączy się z solami żelaza i daje czarne zabarwienie, rosną małe kolonie mogą rosnąć na tym podłożu i w małym stopniu fermentować mannitol. Kolonie ! paciorkowców są małe i łatwo można odróżnić je od kolonii gronkowców w preparacie barwionym metoda Grama lub testem na wytwarzanie katalazy. !

Streptococcus nie wytwarza KATALAZY co odróżnia je od gronkowców

Nie wytwarzają katalazy

* eskulina fluoryzuje w świetle UV o długości fali 360n,. Hydroliza związku prowadzi do zaniku fluorescencji. Powstająca z eskuliny eskeletyna daje czarne zabarwienie z jonami żelazowymi (Fe3+). Obie te cechy zostały wykorzystane w badaniu zdolności bakterii do rozkładania eskuliny. Bakterie hydrolizujące eskulinę zaczerniają pożywkę płynną, która traci jednocześnie zdolność fluorescencji w świetle UV. Na pożywce stałej obserwuje się wzrost czarnych kolonii i często zaczernienie podłoża w ich pobliżu.

Podłoże BEA-podłoże agarowe z żółcią(zahamowanie wzrostu większości bakterii gram+, z wyjątkiem paciorkowców gr. D wg. Lancefield)-eskuliną-azydkiem sodu (zahamowanie wzrostu bakterii gram-) służy do izolacji i różnicowania paciorkowców z gr. D wg. Lancefield. Podłoże Chapman – Mannitol Salt Agar jest wybiórczym podłożem do izolacji i określania liczby gronkowców. Używane jest też do różnicowania gatunków fermentujących i nie fermentujących mannitolu. Właściwości wybiórcze nadaje podłożu chlorek sodu, który obecny w podłożu w wysokim stężeniu hamuje wzrost większości bakterii Gram-ujemnych i Gramdodatnich. Różnicowanie gronkowców opiera się na zdolności fermentacji mannitolu. Fermentacja mannitolu powoduje zakwaszenie i zmianę barwy podłoża w obecności czerwieni fenolowej (wskaźnika pH) na żółtą. Odróżnia gronkowce katalazo+ (żółte kolonie) od katalazo-

3. WYKORZYSTANIE TESTÓW API STREP I STAPH DO IDENTYFIKACJI GRAM-DODATNICH ZIARNIAKÓW API STREP/STREP zawiera 20 mini probówek i zliozfizowane podłoże (do której posiewa się inokulum) do celów identyfikacji aktywności enzymatycznej lub fermentacji cukrów.Testy enzymatyczne wykonuje się z gęstej zawiesiny bakterii wykonanej z czystej kultury. (zmętnienie ocenia się w skali McFarlanda) Podczas inkubacji zmiany metaboliczne powodują zmiany koloru, które ukazują się spontaniczne dzięki dodanym odczynnikom. Testy fermentacyjne-fermentacja węglowodanów jest wykrywana przez wskaźnik pH (zmiana wartości pH). Wyniki odczytuje się zgodnie z tabelą odczytu. Do opakowania również załączona jest lista gatunków, które jesteśmy w stanie odróżnić wykonując testy.

4. ZASADA IDENTYFIKACJI MRSA PRZY WYKORZYSTANIU W REAKCJI PCR, REAKCJA MULTIPLEX I SIMPLEX, SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ DO PCR, WYJAŚNIENIE PROFILU TEMPERATUROWEGO REAKCJI, ZASADA DZIAŁANIA ELEKTROFORETYCZNEGO ROZDZIAŁU PRODUKTÓW PCR

Zasada identyfikacji MRSA przy wykorzystaniu reakcji PCR Identyfikacja oparta na obecności genu nuc (270pz), kodującego pozakomórkową termostabilną nukleazę gronkowców (obecny u wszystkich gronkowców Staphylococcus aureus). Lekooporność potwierdzona obecnością genu mec-A (533pz) kodującego białko PBP nadającego oporność na metycylinę

reakcja MULTIPLEX Technika wykorzystywana w biologii molekularnej, służąca do amplifikacji wielu matryc podczas 1 reakcji PCR. Dzięki jednoczesnemu wykorzystaniu różnych zestawów primerów, metoda ta zapewnia dużą oszczędność czasu i pozwala obniżyć koszty przeprowadzonych badań przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości uzyskanych wyników. zastosowanie: • MRSA-metycolinooorne S.aureus • SARS-CoV-2 • Geny wirulencji H.pylori • Wykrywanie występujących u kleszczy patogenów ludzkich Borelia, Babesia, Anaplasma)

Wady Multiplex PCR • Trudność w dobraniu odp.warunków reakcji • Problemy z doborem starterów • Ryzyku nierównej amplifikacji produkowanych związków z długością produktów lub różną wrażliwością na inhibitory • Możliwość występowania prod. Niespecyficznych ze względu na tworzenie się dimerów między starterami

Reakcja SIMPLEX

amplifikacja 1 genu

skład mieszaniny reakcyjnej do PCR Matrycowe DNA (wyizolowane z próbki) Startery Termostabilna polimeraza DNA (Taq lub Pfu) Odpowiedni bufor reakcyjny (stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej) Jony magnezu Mg2+ Mieszanina 4 dezoksyrybonukleotydów (dNTP)

Profil temperaturowy reakcji Denaturacja DNA (30s-5min.) 94-96C Przyłączenia-hybrydyzacji (annealingu) starterów (15s-1min. 50-65C) Wydłużenia (elongacji) starterów (syntezy DNA) 68-75C)

zasada działania elektroforetycznego rozdziału produktów PCR Barwienie żeli agarozowych • Bromek etydyny jest używany najczęściej, ale jest silnie mutagenny • SYBR green, SYBR gold jest bardzo czuły, nieszkodliwy, degraduje w lekko alkalicznych warunkach, (wada—>Drogi) Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym Wielkość cząsteczki dsDNA liniowe migruje w żelu z szybkością odwrotnie proporcjonalną do ilości par zasad (odwrotnie proporcjonalna do log 10 z masy cząsteczkowej) Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym Stęż. Agarozy-jest liniowa zależność między log. Mobilności elektroforetycznej DNA i stęż. Żelu Żel 0.8%:800-10 000 pz Żel 1%:400-8000pz Żel 1,5%:200-4000pz, Żel 2%:200-3000pz,

Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym • Napięcie prądu-w niskim napięciu stopień migracji liniowych frag. DNA jest proporcjonalny do zaaplikowanego napięcia. W wyższym napięciu mobilność proporcjonalna do napięcia. • Skład buforu do elektroforezy-w roztworach o niskiej sile jonowej DNA migruje wolno, w buforach o zbyt wysokiej sile jonowej przepływ ładunku powoduje wydzielenie się ciepła, co może prowadzić do rozpuszczenia żelu i denaturacji DNA

5 . RÓŻNICOWANIE RODZAJÓW ESCHERICHIA, SALMONELLA, PROTEUS, (CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA, HODOWLA NA PODŁOŻU MCCONKEY’A, NA PODŁOŻU CHROMOGENNYM CHROMOCULT, BADANIE OBECNOŚCI OKSYDAZY, TEST IMVIC, WYSIEW NA PODŁOŻE CHRISTANSEN’A, NA PODŁOŻE KLIGLERA)

Różnicowanie rodzajów Eschrichia, Salmonella, Protesus Rozkład laktozy

Rozkład mocznika Wytwarzanie indolu

Wytwarzanie H2S

Escherichia

+

-

+

-

Salmonella

-

-

-

+

Proteus

-

+

+/-

+

Escherichia Charakterystyka morfologiczna

Proteus

Pałeczki

Hodowla na podłożu McConkey’a

Fermentuje laktozę (laktozo+), rośnie w postaci różowych kolonii

Podłoże MFC

Kolonie barwy ciemnoniebieskiej/fioletowej

Badanie na obecność oksydazy Test IMViC

Salmonella

Nie fermentuje laktozy (laktozo-), więc rosną w postaci kolonii przejrzystych i bzbarwnych

Różowe/czerwone kolonie Oksydazoujemne

Indol: próba dodatnia (różowa/czerwona warstwie na górze probówki)* Czerwień metylenowa: próba dodatnia czerwony kolor, pH niższe niż 4,2)* VP: Próba ujemna* Test cytrynianowy: próba ujemna

Indol: próba negatywna* Czerwień metylenowa: próba dodatnia (czerwony kolor, pH niższe niż 4,2)* VP: Próba ujemna* Test cytrynianowy: próba dodatnia (zmiana zabarwienia na niebiesko)*

Indol: próba dodatnia (różowa/czerwona warstwie na górze probówki)* Czerwień metylenowa: próba dodatnia czerwony kolor, pH niższe niż 4,2)* VP: Próba ujemna* Test cytrynianowy: próba ujemna

Wysiew na podłoże Christensen’a (próba na ureazę)

Próba ujemna—> zmętnienie podłoża (świadczy tylko o obecności dużej ilości bakterii), kolor pozostaje żółty

Próba ujemna —>* zmętnienie podłoża (świadczy tylko o obecności dużej ilości bakterii), kolor pozostaje żółty

Próba dodatnia—>* zmiana barwy na fioletową (rozkład mocznika do CO2 i NH3-alkalizuje podłoże)

Wysiew na podłoże Kliglera (fermentacja laktozy, glukozy i wytw. H2S)

żółty skos i+żółty słupek (oznacza fermentację laktozy i+glukozy), nie wytwarza H2S, brak zaczernienia podłoża. Słupek porozrywany— >fermentacja gazu

Półskos czerwony, czarny słupekwytwarza siarkowodor, nie fermentuje laktozy, fermentuje glukozy, ale nie jesteśmy tego w stanie stwierdzić na pdst. Wysiewu na podłoże Kliglera—> czarny słupek

półsoks czerwony, słupek żółty, wydziela gaz inny niż siarkowodór, nie wytwarza siarkowodoru

Hodowla na podłożu chromatogennym Chromocult

Kolonie barwy ciemnoniebieskiej/fioletowej

Niebiesko-turkusowe, Różowe kolonie ale może zdarzyć się, że Salmonella wyrośnie w postaci przejrzystych kolonii a mikrobiota towarzysząca-kolonie bezbarwne

6. CHARAKTERYSTYKA POZNANYCH RODZAJÓW BAKTERII: Kształt

Barwienie grama

Ruch

Stosunek do tlenu

Przetrwalnikowanie

Streptococcus pneumonie

Dwoinka (ziarniak układający się w pary)

gram+

Brak zdolności ruchu

Tlenowe

Brak

Staphylococcus aureus

Gronkowiec (ziarniak układający się w grona)

Gram+

Brak zdolności ruchu

Tlenowy

Brak

Escherichia coli

Pałeczka

Gram-

Ma rzęski—>. Zdolność do ruchu

Względnie beztlenowa

Brak

Pseudomonas fluorescens

Pałeczka

Gram-

Zdolność ruchu mają zarówno stare jak i młode komórki

Tlenowe

Brak

Bacillus sp.

Laseczka

Gram+

Ruchliwe lub nieruchliwe np. B.anthracis, B.mycoides

Enterococcus

Dwoinka (ziarniak układający się w pary)

Gram+

Ruchliwe są tylko E.casseliflavu, E. Gallinaru, E.flavescens

Proteus

Ruchliwe

Shigella

Brak

Salmonella

Ruchliwa

Yersinia

Brak zdolności ruchu

Pałeczka

Gram-

Citrobacter spp.

Ruchliwe

Klebsiella

Brak zdolności ruchu

Enterobacter

Brak zdolności ruchu

Serratia

Ruchliwa

Tlenowe

Obecne

Brak

Względnie beztlenowe Nieprzetrwalnikujące...