LA Chromatographie- échange d\'ions cours de la biochimie PDF

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La chromatographie est une méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances présentes dans un mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse)....

Description

LA CHROMATOGRAPHIE La chromatographie est une méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances présentes dans un mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse). 

les molécules à séparer sont entraînées par un fluide (un liquide ou un gaz) que l'on appelle la phase mobile.



elles interagissent ou au contraire n'interagissent pas avec un support (ou matrice) fixe (un solide ou un liquide fixé) que l'on appelle la phase stationnaire : il y a donc une distribution ou partition des composants



entre ces deux types de phase. le flux du fluide vecteur étant continu, c'est la rétention plus ou moins longue des différentes molécules sur le support fixe, qui va les séparer les unes des autres.

Les paramètres physico-chimiques sur lesquels reposent les principes de séparation sont : paramètres

type de chromatographie

domaine d'application protéines polypeptides acides aminés acides nucléiques sucres 

 la charge électrique

 

échange d'ions 

protéines polypeptides acides nucléiques  sucres  lipides

 la taille et la forme (en fait, le volume)

l'existence de structures particulières qui permettent

 exclusion ou gel de filtration



affinité



protéines

d'établir des liaisons spécifiques la polarité

polarité de phase inversée

et/ou

ou phase reverse

protéines polypeptides acides aminés acides nucléiques

   

 

sucres acides gras

l'hydrophobicité interactions hydrophobes



protéines

Cependant, si un type de chromatographie repose sur une caractéristique physico-chimique donnée, la séparation peut être influencée de manière "secondaire" par d'autres caractéristiques. Par exemple : 



un échangeur d'ions comportant un groupement hydrophobe, comme le noyau phényl du "DOWEX", interagit aussi par interactions hydrophobes : ainsi pour 2 acides aminés de charge identique, l'hydrophobicité de la chaîne latérale influencera en second lieu la séparation de ces molécules. un gel de filtration "Sephadex" peut être utilisé comme gel d'affinité pour les protéines qui fixent les dérivés du glucose tel que le dextran.

3. Tableau résumé des différents types de chromatographie phase principe de séparation stationnaire liquide

catatéristiques de la phase stationnaire

principe de la fixation et de l'élution

partage

liquide fixé sur un support inerte (papier, silice...)

distribution des composants du mélange à séparer dans les deux phases liquides selon leur coefficient de partage

adsorption

adsorbant solide polaire

adsorption (phase inverse)

molécules hydrophobes greffées sur de la silice résine (polymères d'oses) porteuse de groupements chargés négativement ou positivement

échange d'ions solide exclusion (filtration sur gel)

affinité

solide poreux

phénomène de surface : formation de liaisons spécifiques entre les composants et la surface adsorbante interactions hydrophobes et élution par diminution de la polarité de la phase mobile interactions électrostatiques avec les composants de charge opposée les composants de diamètre supérieur à celui des billes du support sont "exclus" et ceux de diamètre inférieur y diffusent et sont freinés

support sur lequel est greffée déplacement de l'équilibre de liaison [molécule une molécule (le ligand) spécifiquement reconnue par un ligand greffé] en faveur de l'équilibre [molécule des composants de l'échantillon tierce molécule] à analyser

4. Les supports ou matrices pour phases stationnaires Le support ou matrice utilisé pour constituer la phase stationnaire s'appelle un gel de résine. Ce gel se présente souvent sous la forme de billes (sphériques ou, plus rarement, de forme irrégulière). Ces billes sont elles mêmes des polymères de différents types de molécules, par exemple :  

de styrène - divinylbenzène pour certaines résines d'échange d'ions de polyholosides pour les gels de filtration



de silice pour la chromatographie en phase reverse

Différents traitements ou modifications de ces différentes résines permettent d'obtenir tel type de phase stationnaire ou tel autre type.

II. Chromatographie d'échange d'ions 1. Les différents types d'échangeurs d'ions Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :

positive : résines échangeuses d'anions qui fixent des molécules négative : résines échangeuses de cations qui fixent chargées négativement : ---R+...Mdes molécules chargées positivement : ---R-...M+ nature de la fonction ionisable : ---R+ base forte

base faible

nature de la fonction ionisable : ---Racide fort

acide faible

exemple : sulfonate

exemple : carboxyméthyl

forme protonnée d'une amine I, II ou III : ---NHR2+ ammonium quaternaire : ---NR3+ exemple : triméthylammonium ---N(CH3)3

exemple : diéthylaminoéthylammonium

+

---SO3-

---O-CH2-CO2-

2. Principe. Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :  

dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pK a du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5) dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pKa du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement carboxyméthyl est 4)

Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge nette :   

négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7 nulle positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7

Voir un exemple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH Voir la relation de Henderson - Hasselbach. Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :





En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées. En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion.

L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant :   

cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+ cations divalents : Cd2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ca2+ de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca2+ < Al3+

III. Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel 1. Remarque préliminaire Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer. En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères. Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :  



la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire. les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géomètrie des protéines glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides. la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ...

2. Principe. La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex" ou "Sepharose") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :   

le volume des billes est très finement calibré. ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement. en revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent et y subissent des frottements qui les retardent.

En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté : c'est celui dont le domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier ( voir un exemple). 3. Détermination de la masse molaire d'une molécule. Un mélange de molécules que l'on appelle standards , de masses molaires connues, est séparé par chromatographie de

filtration sur gel (voir un exemple de séparation) :  



chaque molécule est éluée avec un volume d'élution Ve. par ailleurs, le volume d' exclusion du gel (V0) est le volume d'élution d'une molécule non retardée par le gel, c'est-à-dire une molécule de taille supérieure à celle des billes et qui n'y diffuse pas. Bien souvent, on utilise le bleu dextran, polymère d'ose de masse molaire supérieure à 2 106 Da. enfin, le volume total du gel (Vt) est la somme du volume des billes et du volume externe aux billes : il est donné par le volume d'élution d'une molécule qui diffuse totalement dans les billes et qui est donc totalement retardée.

On définit le coefficient de partition : Ve - V0 KD = ----------Vt - V0   

on trace la droite étalon : log (masse molaire) = f (K D) (ou masse molaire = f (K D) sur une échelle semilogarithmique) on détermine le volume d'élution d'une molécule X dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des standards on reporte le KD de la molécule X sur la partie linéaire de la droite étalon et ainsi on détermine sa masse molaire

IV. Chromatographie d'affinité 1. Principe et applications C'est le type de chromatographie le plus sélectif, une protéine pouvant être purifiée d'un facteur 10 3 à 104 en une seule fois. Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la reconnaissance entre une molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la résine, que l'on appelle le ligand, ces deux molécules interagissant de manière hautement spécifique :

l'adsorption de la molécule à séparer sur le ligand fixé à la résine est effectuée dans des conditions physicochimiques (pH, force ionique, concentration de la molécule à adsorber...) favorables à la liaison molécule ligand. dans ces conditions, les molécules du mélange à séparer qui n'ont pas (ou peu) d'affinité pour le ligand sont éluées au fur et à mesure qu'on le fait passer sur la résine. on désorbe ensuite les molécules spécifiquement fixées au ligand en modifiant les conditions physicochimiques de telle sorte que la liaison molécule - ligand soit rompue : le plus souvent, on ajoute une tierce molécule qui entre en compétition avec le ligand greffé pour la molécule à séparer. En d'autres termes, on déplace l'équilibre de liaison molécule - [ligand greffé] en faveur de l'équilibre molécule - [tierce molécule].



 

Cette tierce molécule peut-être : le ligand greffé lui-même (sous forme libre) à une concentration plus élevée que celle du ligand greffé une molécule dont la structure est analogue à celle du ligand greffé mais pour laquelle la molécule a plus d'affinité

 

L'une des principales applications de la chromatographie d'affinité est l'isolement de protéines ou d'acides nucléiques dont voici quelques exemples :

ligand protéine A (recombinante) : protéine de Staphylococcus aureus à haute affinité pour le fragment Fc des anticorps de type IgG ; protéine G (recombinante) : protéine de surface des streptocoques du groupe G, récepteur de type III du fragment Fc des anticorps de type IgG.

 

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exemples de molécules isolées



ADN natif ou dénaturé de thymus de veau

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



poly(U) (acide polyuridylique)

 



plasminogène ARN ribosomal

métalloprotéines  protéines à groupements cis-diol



colorants de l'industrie textile (exemple : bleu de procion ou "Cibacron blue®") : les enzymes qui fixent les monoou dinucléotides puriques interagissent avec les cycles portés par les colorants dont la structure est très proche de celle du NAD+.  voir l'exemple du "Bleu A"



polymerases (ADN, ARN)  exonucléases



lysine

iminodiacétate : chélateur de métaux  boronate

fixation sur des résidus α-Dmannopyranosyl ou α-Dglucopyranosyl terminaux des glycoprotéines



concanavaline A (les lectines en général) : protéines qui se fixent sur des résidus spécifiques de la partie osidique des glycoprotéines et qui ont des propriétés agglutinantes (exemple : érythrocytes).



Immuglobulines G de mammifères  exonucléases



déshydrogénases à NAD(P)+ kinases dépendantes de l'ATP

ARN messagers par hybridation à



leur queue poly(A) protéines se liant au poly (U) (interféron, transcriptase inverse)

2. Structure de gels d'affinité - Activation du gel pour le couplage du ligand - Bras espaceurs Les supports ou matrices utilisés pour la chromatographie d'affinité peuvent être des billes d' agarose ("Sepharose", Pharmacia), de polyacrylamide d'agarose, de verre poreux, de polyvinyle, de polyméthacrylate ... L'immobilisation du ligand sur la matrice nécessite qu'il soit préalablement activé, c'est-à-dire qu'il faut créer des sites réactionnels qui permettent d'établir des liaisons covalentes. Parmi les diverses méthodes d'activation, on peut citer : 

  

l'activation des groupes hydroxyles du support (l'agarose par exemple) par le bromure de cyanogène dans une solution dont le pH est finement contrôlé (pH 8,3). Des groupements imidocarbonates sont formés sur lesquels on peut fixer des ligands contenant des amines libres, par exemple une protéine par la chaîne latérale de ces lysines. Les groupes hydroxyles qui n'ont pas réagit sont bloqués par action de l'éthanolamine ou la glycine. les groupes hydroxyles du support peuvent être activés par le carbonyl di-imidazole. l'activation du support peut être faite avec le gtutaraldéhyde qui se polymérise et forme des chaînes à 5 carbones qui constituent des points de fixation à une certaine distance de la matrice. une autre méthode d'activation utilise le chlorure de tosyle et elle permet le couplage de molécules qui possèdent un groupement aminé, thiol ou phénol.

Pour rendre certains ligands accessibles au site de fixation sur la molécule avec laquelle ils interagissent, il est nécessaire d'augmenter la longueur de la chaîne carbonée à l'extrémité de laquelle se situe le groupement activé. Cette chaîne additive s'appelle un bras espaceur. La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective. Cependant, c'est aussi la plus délicate à mettre en oeuvre car elle nécessite la mise au point des conditions expérimentales idoines pour obtenir un gel correctement activé :    

le ligand doit être orienté de manière optimale pour une parfaite reconnaissance stéréochimique de la molécule que l'on veut séparer il ne faut pas que le ligand subisse l'action des enzymes, c'est pour celà qu'on utilise davantage des analogues de substrats (inhibiteurs compétitifs par exemple) que les substrats eux-mêmes il faut trouver des conditions d'élution de la molécule fixée au ligand qui préserve sa fonction biologique en conséquence, cette méthode chromatographique est coûteuse

V. Chromatographie d'adsorption à polarité de phase inversée ou phase reverse V.A. Chromatographie à polarité de phase inversée ou en phase reverse 1. Structure du gel de silice Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice (SiO2), appelée aussi gel de silice car elle est plus ou moins hyratée : 

la silice provient de la déshydratation de l'acide silicique et se présente sous forme d'une poudre dont les grains (les billes) sont très fins

  

ces billes peuvent être sphériques ou irrégulières à la surface de la silice on trouve des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-) qui lui confèrent un caractère polaire et acide et qui lui permettent de former des liaisons hydrogènes on utilise fréquemment une silice sur laquelle des chaînes alkylées (ou autres, voir les différents groupes utilisés) sont greffées au niveau des groupements silanols

2. Principe de l'adsorption et de la désorption en phase reverse (voir un schéma) Les chaînes alkylées confère à la silice un caractère très hydrophobe :   

si la phase mobile est très polaire (donc très peu hydrophobe), certaines molécules hydrophobes vont établir des interactions hydrophobes avec la phase stationnaire et ainsi être adsorbées on augmente alors la concentration en solvant organique (apolaire donc hydrophobe) dans la phase mobile à une concentration donnée l'hydrophobicité de la phase mobile étant plus importante que celle de la phase stationnaire, les molécules hydrophobes sont désorbées et éluées

La phase mobile est donc constituée d'un mélange eau / solvant organique, en proportion variable : a. la phase aqueuse : 

l'eau est le solvant le plus polaire (le moins hydrophobe).

On ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort (l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car ces deux composés ioniques forment des paires d'ions avec les molécules à séparer, neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la phase stationnaire. b. le solvant organique :  



il en existe un grand nombre que l'on peut utiliser puisque la silice leur résiste. Cependant, les plus employés sont l'acétonitrile et le méthanol. le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des molécules à séparer : pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible. les solvants organiques ne doivent pas comporter d'impurétés ni avoir une forte absorbance aux faibles longueurs d'onde (ultra-violet) pour ne pas interférer avec les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus selon sa qualité, on peut ou non utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donnée. En conséquence, il faut prendre des solvants certifiés "ultra-purs" qui coûtent chers.

3. Exemples d'application La chromatographie en phase reverse s'applique quasiment à tous les types de molécules. C'est une méthode de chromatographie extrêmement efficace qui permet de séparer des é...