Lab 4 Flora człowieka Miano Coli - mikrobiologia PDF

Preview

Summary

Flora człowieka Miano Coli - mikrobiologia lab.4...

Description

Laboratorium 4

Mikrobiologia

Mikroorganizmy w różnych środowiskach. Miano coli. Typy wzrostu mikroorganizmów.

Część teoretyczna 

Powietrze jako środowisko bytowania mikroorganizmów

Atmosfera nie jest siedliskiem bytowania bakterii, jedynie ośrodkiem, w którym

bakterie się

rozprzestrzeniają. Dostają się one do atmosfery z cząsteczkami pyłu, kropelkami cieczy oraz unoszone są przez

wiatr.

Wydalane

są

także

przez

zwierzęta

z

wydychanym

powietrzem.

W powietrzu mogą występować przez dłuższy czas a ich przeżycie w określonych warunkach atmosferycznych

zależy

od

odporności

na

wysuszanie

i

promieniowanie

słoneczne.

Duże znaczeni odgrywają otoczki, które chronią komórkę bakteryjną przed działaniem czynników zewnętrznych. Najszybciej giną formy wegetatywne, najdłużej pozostają przy życiu formy przetrwalnikowe. W powietrzu unoszą się formy chorobotwórcze bakterii tj. prątki gruźlicy czy bakterie zapalenia płuc. Są one wrażliwe na czynniki środowiskowe i w powietrzu nie przeżywają bardzo długo. W klimacie ciepłym w powietrzu jest znacznie więcej mikroflory niż w klimacie umiarkowanym, najmniej zaś w strefie polarnej. Liczebność drobnoustrojów jest najniższa w powietrzu suchym, o niskiej zawartości drobin kurzu i wysokiej temperaturze.

Dominującą

mikroflorę

powietrza

stanowią

zarodniki

grzybów

strzępkowych

(Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Mucor), przetrwalniki Bacillus sp . Clostridium sp., ziarniaki z rodzajów Micrococcus i Sarcina oraz gronkowce białe (Staphylococcus).



Gleba jako środowisko bytowania mikroorganizmów

Gleba jest najbogatszym rezerwuarem mikroorganizmów, występuję tu również największa różnorodność typów drobnoustrojów: Pseudomonas, Enterobacter, Proteus, Enterococcus, Mikrococcus, Bacillus oraz Clostridium, drożdże i pleśń. Szczególnym narażeniem jest gleba zakażona fekaliami, która może być źródłem patogenów jelitowych i wirusów. 

Woda jako środowisko bytowania mikroorganizmów

Środowisko wodne można podzielić na 2 typy, które nawzajem się przenikają-toń wodna i osady denne. W obu tych środowiskach występują liczne gatunki bakterii. W wodzie w przewadze występują bakterie gram-ujemne, psychrofilne i zdolne do wzrostu nawet w obecności śladowych ilości pożywienia.

Laboratorium 4

Mikrobiologia

Bakterie heterotroficzne w środowisku wodnym są najliczniej reprezentowane przez rodzaje: Vibro, Pseudomonas,

Aeromonas,

Selenomonas,

Spirillum,

Spirochaeta.

Występujące

w wodzie autotrofy to Nitrosomonas, Nitrobacter, bakterie siarkowe i żelazowe. W warstwie powierzchniowej wody mogą okresowo występować drobnoustroje pochodzące z gleby (Bacillus sp), powietrza, ścieków przemysłowych i komunalnych (bakterie ściekowe Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Clostridium sporogenes; mikroflora jelitowa człowieka i zwierząt np. E. coli, paciorkowce kału), drobnoustroje chorobotwórcze: pałeczki duru ( Salmonella), czerwonki (Shigella), przecinkowce cholery (Vibrio cholerae).

Analiza mikrobiologiczna wody opiera się na pośrednim wnioskowaniu o obecności mikroorganizmów chorobotwórczych na podstawie liczebności w wodzie bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. Obecność tych drobnoustrojów w wodzie świadczy

o

zanieczyszczeniu

fekaliami

i

wskazuje

na

niebezpieczeństwo

zakażenia

wody

mikroorganizmami chorobotwórczymi. Bakterie uważane za wskaźniki mikrobiologicznego skażenia wody fekaliami powinny spełniać następujące warunki: 1. muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym, ich liczebność w jelicie i kale powinna być duża 2. ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod 3. długość życia bakterii wskaźnikowych w wodzie musi być dłuższa niż długość życia gatunków chorobotwórczych 4. bakterie te nie powinny rozmnażać się w środowisku wodnym 5. do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należeć także formy niewytwarzające przetrwalników, aby umożliwić wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody Jako wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody stosuje się następujące mikroorganizmy: Escherichia coli, bakterie

z

grupy

coli,

paciorkowce

kałowe

z

rodzajów

Enterococcus

i Streptococcus, laseczki z rodzaju Clostridium (Clostridium perfringens) oraz w niektórych przypadkach gronkowce koagulazo-dodatnie, Pseudomonas aueruginosa, Legionella sp.



Człowiek jako środowisko bytowania mikroorganizmów-naturalna mikroflora ciała człowieka

Mikroflora okrężnicy człowieka W okrężnicy człowieka znajduje się około 1012 bakterii na gram zawartości, co stanowi około 30% treści okrężnicy. W skład tej mikroflory wchodzą głównie bezwzględnie beztlenowe bakterie Gram-ujemne (Bacteroides) i Gram-dodatnie (Clostridium, Peptostreptococcus, Clostridium). Bakterie żyjące w okrężnicy jako źródło energii wykorzystują wielocukry pochodzące z pokarmu, takie jak celuloza, ksylan i

Laboratorium 4

Mikrobiologia

pektyna. Produkty końcowe fermentacji wielocukrów przez bakterie to octan, propionian i maślan, które są następnie wchłaniane przez komórki błony śluzowej okrężnicy i wykorzystywane przez organizm człowieka jako źródło energii. Ponadto, obecne w jelicie bakterie z rodzajów Bacteroides, Lactobacillus i Bifidobacterium uczestniczą w produkcji niezbędnych dla człowieka witamin K oraz biotyny. Escherichia coli (pałeczka okrężnicy): Gram-ujemna pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae, względny tlenowiec, wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt stałocieplnych, w jelicie pełni pożyteczną rolę, uczestnicząc w rozkładzie pokarmu oraz w produkcji witamin z grupy B, K oraz C. E. coli może występować w glebie lub wodzie na skutek zanieczyszczenia kałem. Mimo, że w jelicie E. coli nie jest szkodliwa, może powodować groźne schorzenia przewodu pokarmowego, dróg moczowych oraz dróg oddechowych. Mikroflora skóry człowieka Skóra człowieka nie jest dogodnym środowiskiem dla życia mikroorganizmów, ponieważ jest sucha i zawiera

obumarłe

komórki,

a

mikroorganizmy

preferują

środowiska

wilgotne

i zawierające składniki odżywcze łatwiej dostępne niż te zawarte w obumarłych komórkach naskórka. Ponadto powierzchnia skóry ma odczyn lekko kwaśny (pH 5.5), co również nie sprzyja wzrostowi mikroorganizmów w większości przystosowanych do życia w pH 7. Są jednak mikroorganizmy, które potrafią żyć na powierzchni skóry, a ich obecność jest w większości przypadków obojętna lub korzystna dla człowieka. Ze względów zdrowotnych należy ograniczać ilość mikroorganizmów obecnych na skórze poprzez zachowywanie odpowiedniej higieny, jednak nie powinno się usiłować pozbyć całkowicie mikroorganizmów skórnych, gdyż miałoby to niekorzystne skutki dla zdrowia. W skład naturalnej mikroflory skóry człowieka wchodzą m. in.: a) Staphylococcus epidermidis – ziarniak Gram-dodatni, w normalnych warunkach nie jest szkodliwy dla człowieka, jednak może prowadzić do groźnych infekcji u pacjentów, którym podaje się leki w formie kroplówki (bakterie mogą dostać się przez igłę kroplówki do krwioobiegu); S. epidermidis jest również niebezpieczny, gdy na skutek niestaranności chirurga zostanie przeniesiony na wszczepiany implant. Na plastikowych implantach bakteria ta tworzy biofilm, który jest oporny na leczenie antybiotykami. W takich sytuacjach zwykle konieczna jest chirurgiczne usunięcie i wymiana zakażonego implantu na sterylny. b) Propioni bacteriumacness– pałeczka Gram-dodatnia, jest bezwzględnym beztlenowcem, dlatego jest obecna w obszarach skóry o ograniczonym dostępie tlenu (pory, gruczoły skórne), nazwa tego gatunku pochodzi stąd, że był on uważany za przyczynę powstawania trądziku na skórze, jednak jego powszechne

Laboratorium 4

Mikrobiologia

występowanie na skórze, również u osób nie cierpiących na trądzik budzi wątpliwości o roli tej bakterii w powstawaniu trądziku. Mikroflora nosa człowieka Mikroflorę nosa człowieka stanowią głównie bakterie Gram-dodatnie, częściowo te same, które stanowią mikroflorę skóry. Jednym z mikroorganizmów zasiedlających jamę nosowa jest Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty), produkujący białkową toksynę - enterotoksynę, która po spożyciu wraz z zakażonym pokarmem powoduje gwałtowne wymioty i skurcze jelita. Dolegliwości układu pokarmowego spowodowane zakażeniem S. aureus rzadko kończą się śmiercią, znacznie poważniejsze skutki ma nosicielstwo S. aureus przez personel medyczny, gdyż zakażenia ta właśnie bakterią są główną przyczyną zakażeń ran pooperacyjnych oraz zakażeń krwi nabywanych w szpitalach i innych placówkach służby zdrowia. Mikroflora jamy ustnej człowieka Mikroflora jamy ustnej człowieka zmienia się wraz z wiekiem. Pierwszymi drobnoustrojami zasiedlającymi jamę ustna dziecka są Gram-dodatnie ziarniaki Streptococcus salivarius oraz Gramdodatnie pałeczki z rodzaju Lactobacillus. Z chwila pojawienia się zębów w jamie ustnej pojawiają się także Gram-dodatnie aerotolerancyjne beztlenowce Streptococcus sanguis, Streptococcus mutant oraz bezwzględne beztlenowce Actinomyces sp. Na powierzchni zębów u osób dorosłych dominują bakterie kwasu mlekowego z rodzaju Streptococcus (S. sanguis, S. salivarius), które przyczyniają się do rozwoju próchnicy zębów. Groźniejszym drobnoustrojem z rodzaju Streptococcus, który także kolonizuje jamę ustna jest S. pneumoniae – najpowszechniejsza przyczyna zapalenia ucha u dzieci oraz zapalenia płuc u dorosłych. Bakteria ta jest obecna w jamie ustnej u około 25% populacji i w stanach osłabienia i obniżonej odporności może wywołać poważną chorobę. Mimo, że w skład mikroflory jamy ustnej człowieka wchodzą głównie bakterie, występują w niej również drożdże, na przykład Candida albicans. Gatunek ten jest zwykle nieszkodliwy dla człowieka, jednak może wywoływać chorobę u ludzi leczonych antybiotykami lub o osłabionej odporności. C. albicans jest również przyczyna występowania pleśniawki (afty) – łagodnego stanu zapalnego jamy ustnej u dzieci, u których mikroflora nie jest jeszcze w pełni wykształcona.

Miano coli Miano coli to najmniejsza objętość badanej wody (wyrażona w cm 3), w której znajdują się jeszcze bakterie z grupy coli. Jeżeli np. stwierdzimy obecność pałeczek okrężnicy w 100 cm 3wody a nie ujawnimy

Laboratorium 4

Mikrobiologia

ich występowania w 75 cm 3, to przyjmujemy miano coli badanej wody za 100. Obecność w wodzie bakterii z grupy coli bada się stosując m.in. metodę fermentacyjno-probówkową. Metoda fermentacyjno-probówkowa: Wykrywanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową opiera się na wykorzystaniu zdolności tych bakterii do fermentacji laktozy z wytworzeniem produktów kwaśnych i gazowych. Przeprowadzenie oznaczenia obejmuje 4 etapy, a mianowicie : • badanie wstępne, • badanie potwierdzające, • badanie uzupełniające, • badanie ostateczne, czyli identyfikujące.

Etap I. Badanie wstępne polega na posiewie odpowiednio rozcieńczonych próbek badanej wody na podłoże płynne, zawierające m.in. laktozę i barwnik - purpurę bromokrezolową (podłoże Eijkmana). Purpura bromokrezolowa spełnia rolę wskaźnika, zmieniającego swoje zabarwienie w zależności od pH. Gaz wytwarzający się podczas fermentacji zbiera się w odwróconych do góry dnem małych probówkach zwanych rurkami Durhama. O dodatnim wyniku badania świadczy obecność pęcherzyków gazu w rurce Durhama przy jednoczesnym zmętnieniu podłoża i jego zakwaszeniu (zmiana barwy podłoża z fioletowej na żółtą). Brak choćby jednej z wymienionych cech należy traktować jako wynik wątpliwy, wymagający przeprowadzenia badań potwierdzających. Etap II. Badania potwierdzające sprowadzają się do posiewu kropli hodowli uzyskanej w trakcie badań wstępnych na podłoże Endo lub podłoże MacConkeya. Na podłożu Endo bakterie grupy coli rosną w postaci ciemnoczerwonych kolonii o metalicznym zielonkawym połysku, natomiast na podłożu MacConkeya bakterie te pojawiają się jako czerwone kolonie, wokół których obserwuje się wyraźne zmętnienie pożywki. Kolonie nietypowe należy poddać badaniom uzupełniającym. Etap III. Badania uzupełniające obejmują powtórną próbę fermentacyjną na podłożu laktozowym, sporządzenie preparatów mikroskopowych i wybarwienie ich

metodą Grama, wykonanie testu na

obecność oksydazy cytochromowej. Stwierdzenie zdolności badanych bakterii do fermentacji laktozy, obecność w preparacie mikroskopowym pałeczek Gram-ujemnych oraz brak zdolności do wytwarzania oksydazy cytochromowej (ujemny wynik testu) świadczą o występowaniu w próbkach wody bakterii z grupy coli.

Laboratorium 4

Mikrobiologia

Etap IV. Badania identyfikacyjne obejmują szereg testów biochemicznych zmierzających do ustalenia przynależności taksonomicznej szczepów bakteryjnych wyosobnionych podczas etapu II. Badania te prowadzi się w uzasadnionych przypadkach, np. podczas epidemii, gdy zarówno badania wstępne, jak i badania potwierdzające oraz uzupełniające dają wyniki wątpliwe. HODOWLE DROBNOUSTROJÓW-ICH WZROST Obserwacja wzrostu drobnoustrojów na pożywkach należy do ważnych informacji diagnostycznych przy identyfikacji drobnoustrojów. W zależności od rodzaju podłoża w diagnostyce uwzględnia się różne cechy. Rodzaj pożywki Płynna pożywka bulionowa

Pożywka Petriego

stała

na

Charakterystyczne cechy wzrostu występowanie błonki charakter błonki zmętnienie lub osad charakter zmętnienia stopień zmętnienia osad zapach płytkach wymiary kolonii kształt kolonii brzeg kolonii powierzchnia kolonii konsystencja barwa kolonii lub podłoża wyniosłość - profil

Charakter wzrostu na podłożu płynnym pozwala na określenia zapotrzebowania bakterii na tlen: 1. bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni pożywki w postaci pierścienia, błonki lub kożucha utworzonych z komórek; w zależności od gatunku bakterii kożuch może być biały, zabarwiony, suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający się, kłaczkowaty, wznoszący się po ściankach (np. Nocardia (G+), Pseudomonas aeruginosa (G-), większość laseczek z rodzaju Bacillus). 2. względne beztlenowce charakteryzuje wzrost dyfuzyjny, objawiający się jednolitym zmętnieniem całej objętości pożywki (np. drożdże, bakterie denitryfikacyjne). 3. bezwzględne beztlenowce rosną w postaci osadu na dnie probówki; po wstrząśnięciu osad unosi się w sposób pylisty, osiadający, kłaczkowaty lub ziarnisty. 4. mikroaerofile rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu od powierzchni pożywki. Charakter wzrostu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego 1. kształt kolonii: kolisty, nieregularny, soczewkowaty, nitkowaty, rozgałęziony

Laboratorium 4

Mikrobiologia

2. brzeg kolonii: gładki, falisty, płatowaty, nitkowaty z obwódką

3. profil kolonii ponad powierzchnię pożywki: płaski, wyniosły, soczewkowaty, pępkowaty

4. barwa kolonii i jej przejrzystość: przeźroczysta, mętna, opalizująca, nieprzeźroczysta oraz zdolność do wytwarzania pigmentu zabarwiającego otoczenie kolonii: zabarwione, niezabarwione

Laboratorium 4

Mikrobiologia

Część praktyczna Posiew redukcyjny ezą lub głaszczką zaszczepionego na poprzednich zajęciach innoculim

Liczba drobnoustrojów w powietrzu 1. Policz wyrosłe kolonie drobnoustrojów na płytkach Petriego (oznaczanie mikroorganizmów w powietrzu). Oznacz ilość drobnoustrojów w 1m 3 powietrza (metodą sedymentacyjną Kocha) stosując poniższy wzór Omeliańskiego:

x=

a x 100 x 100 b xc

gdzie: x – liczba drobnoustrojów w 1m3 powietrza a – liczba koloni wyrosłych na płytce b – powierzchnia płytki (cm2) –dla płytki o średnicy 10 cm wynosi 78,5 cm2 c – współczynnik czasu otwarcia płytki 5min = 1, 10min = 2 itd. 100 – przelicznik powierzchni płytki na 100cm2

Liczba drobnoustrojów: Mniej niż 1000- powietrze niezanieczyszczone 1000-3000 – powietrze średnio zanieczyszczone Więcej niż 3000 – powietrze silnie zanieczyszczone

Analiza kolonii wyrosłych na szalkach Petriego

1. Przeanalizuj wyrosłe na szalkach Petriego mikroorganizmy. Scharakteryzuj ich kolonie.

Laboratorium 4

Mikrobiologia

Oznaczanie liczby bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową 1. Przygotuj 4 probówki zawierające 10ml jałowego podłoża laktozowego Eijkmana 1 z odwróconą rurką Durhama. 2. Podpisz odpowiednio probówki (w zależności od rodzaju wody) oraz probówkę kontrolną zaznaczając także numer grupy i datę. 3. Do każdej z probówek dodaj 1 ml odpowiednio rozcieńczonej lub nierozcieńczonej próbki wody, pamiętając o zachowaniu sterylności! 4. Wszystkie probówki z posianym podłożem umieść w cieplarce. 5. Po 24, a następnie po 48 godzinach obejrz hodowle i zobacz, w których probówkach obecne są bakterie grupy coli (tzn. w których probówkach doszło do zmętnienia podłoża, zmiany barwy na kolor żółty oraz pojawienia się pęcherzyków gazu w rurkach Durhama). Brak gazu i zakwaszenia (zmiana barwy) po 48h inkubacji przyjmuje się za wynik ujemny. Obecność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub jego braku uznaje się za wynik wątpliwy, wymagający dalszego potwierdzenia.

1podłoże różnicujące do stwierdzania zdolności fermentacji laktozy przez bakterie z grupy coli w analizie

wody; zawiera pepton, laktozę, NaCl i purpurę bromokrezolową (wskaźnik alkacymetryczny)

Laboratorium 4

Mikrobiologia...