Mikrobiologia przemysłowa - WYKŁADY PDF

Preview

Summary

Download Mikrobiologia przemysłowa - WYKŁADY PDF

Description

WYKŁAD 1 •

Egzamin 17.01, 24.01

•

4 pytania otwarte, 50% na zaliczenie

•

www.eportal.pwr.edu.pl

Drobnoustroje wykorzystywane w biotechnologii powinny zapewniać •

Wysoką jakość produktu

•

Powtarzalność prowadzonych procesów

Wybór mikroorganizmów dla danego procesu technologicznego uwzględnia: •

Sposób odżywiania (składniki odżywcze, napowietrzanie, naświetlanie)

•

Optimum temperaturowe (musi być skorelowane ze stabilnością związków, które ma organizm produkować)

•

Wzrost w aparaturze przemysłowej

•

Stabilność cech oraz odporność na manipulacje genetyczne

•

Produktywność

•

Łatwość wydzielania produktu z medium pofermentacyjnego (najlepiej gdy wychodzi on na zewnątrz)

•

Brak toksycznych produktów metabolizmu

Pozyskiwanie szczepów o znaczeniu przemysłowym •

Izolacja nowych mikroorganizmów o pożądanych cechach

•

Badanie znanych szczepów (nowe sposoby hodowli, bardziej czułe metody analityczne)

Źródła szczepów przemysłowych •

Środowisko naturalne

•

Środowisko przekształcone przez człowieka (aby wyizolować konkretny drobnoustrój)

•

Kolekcje szczepów

Kolekcje mikroorganizmów – instytucja naukowa ze szczepami •

Cel kolekcji •

•

•

Zapewnienie referencyjnych szczepów dla celów badawczych, porównawczych, edukacyjnych

Przechowywane szczepy – cechy •

Aktywność

•

Stałe cechy (fizjologiczne i produkcyjne)

Zadania kolekcji 1

•

Poszukiwanie nowych szczepów o przydanych cechach i ulepszanie metodami klasycznymi i inżynierii genetycznej

•

Klasyfikacja i identyfikacja

•

Badania nad doborem skutecznych metod przechowywania w warunkach laboratoryjnych

Przykłady kolekcji •

ATCC – drożdże, bakterie, pleśnie

•

NRRL – drożdże, bakterie, grzyby strzępkowe, glony

•

DSMZ – drożdże, pleśnie, plazmidy, wirusy

•

CBS – grzyby strzępkowe, drożdże, porosty, możliwość deponowania materiału genetycznego mikroorganizmów

•

NCTC – bakterie

•

CCM – bakterie i grzyby strzępkowe

•

CCY – drożdże i promieniowce

WFCC – Światowa Federacji Kultur w Japonii, kolekcje światowe muszą być zrzeszone z WFCC Polskie kolekcje należące do WFCC •

PCM – Polska Kolekcja Mikroorganizmów (Wrocław)

•

ŁOCK – Ośrodek Czystych Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych (Łódź)

•

DMVB – Państwowa Kolekcja Szczepów Oddziału Weterynarii (Puławy)

•

IAFB – Kolekcja Mikroorganizmów Przemysłowych (Warszawa)

•

KOS – Ośrodek Szczepów Salmonella Morskiego Instytutu Medycyny (Warszawa)

•

CPPPI – Kolekcja Patogenów Roślin (Poznań)

Atrybuty dobrej kolekcji •

Wykwalifikowana kadra naukowa

•

Katalog szczepów i usług

•

Metryczki szczepów

Metryczka szczepów •

Numer kolekcyjny

•

Nazwa gatunkowa i synonimy szczepu

•

Data wprowadzenia do kolekcji

•

Metodyka przechowywania

•

Cechy morfologiczne, biochemiczne – wygląd pojedynczej komórki oraz kolonii 2

•

Właściwości toksyczne i chorobotwórcze

Pierwszy zdeponowany szczep przemysłowy •

1949r., NRRL (USA) Streptomyces aureofaciens – producent tetracykliny

Przechowywanie szczepów powinno zapewnić •

Czystość mikrobiologiczna

•

Maksymalna żywotność komórek (nawet przy bardzo małej przeżywalności, komórki powinny posiadać cechy biotechnologiczne na poziomie kultury wyjściowej)

•

Stabilność cech fizjologicznych i genetycznych, głównie produktywność metabolitów pierwotnych wtórnych

Przechowywanie – dobór indywidualny •

Okresowy przesiewy na podłoża stałe lub płynne i przechowywanie tych hodowli w temp. Pokojowej lub 4 stopni C

•

Skosy agarowe zalane jałową parafiną

•

Metoda opracowana indywidualnie – szczególnie cenny szczep

Jak pozyskujemy nowe szczepy mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym? Etapy pozyskiwania nowych szczepów •

Wybór miejsca

•

Pobieranie próby ze środowiska

•

Wstępna obróbka próbki

•

Izolacja

•

Testy selekcyjne

•

Testy fermentacyjne

•

Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu

Wybór miejsca i pobranie ze środowiska •

Środowisko (naturalne lub przekształcone przez człowieka) – wybrane racjonalne źródło mikroorganizmów o spodziewanych pożądanych cechach biotechnologicznych

•

Izolacja z zastosowaniem klasycznych technik mikrobiologicznych

•

Kryterium wyboru miejsca pobrania próby – założenia projektowe

Założenia projektowe: Wydajna enzymatyczna hydroliza laktozy w mleku w temperaturze 10-15 stopni C •

Miejsce pobrania próby: środowiska naturalne bogate w gatunki psychrofilne i psychotrofowe – gleba regionów polarnych, gleby wysokogórskie, wody mórz i oceanów, wody jezior polarnych 3

Założenia projektowe: Przetwórstwo skrobi – wytwarzanie syropów glukozowych •

Miejsce pobrania próby: środowiska naturalne obfitujące w gatunki mikroorganizmów termofilnych i hipertermofilnych – gorące źródła, solfatary

Założenie projektowe: Nowe antybiotyki •

Miejsce pobrania próby: środowiska naturalne obfitujące w gatunki promieniowców – gleba, torfowiska, rozkładająca się masa roślinna

Założenia projektowe: Bioremediacja (przywrócenie stanu z przed katastrofy ekologicznej) gleby skażonej produktami ropopochodnymi •

Miejsce pobrania próby: środowiska obfitujące w gatunki mikroorganizmów zdolnych do biodegradacji węglowodanów – gleba okolic lotnisk, stacji paliw, torowisk kolejowych

WYKŁAD 2 Pobranie próby ze środowiska Izolacja gatunków dominujących w populacji w danym środowisku - rutynowa Problem: mikroorganizmy potencjalnie przydatne w procesach przemysłowychto tylko niewielki odsetek całej populacji. Prowadząc badania określamy zawartość ogranizmów ważnych dla naszego projektu ale też inne organizmy - są to oznaczenia zarówno ilościowe jak i jakościowe. Miejsce pobrania próbki: lotnisko stacja paliw torowisko kolejowe Sposoby zwiększenia liczebności poszukiwanych drobnoustrojów: -oddziałuwanie na środowisko przed pobraniem próby (np. odpady ze stacji paliwowym zwiększa się liczba bakterii degradujących związki ropopochodne) -wprowadzenie do środowiska wabików, atraktantów - pułapek (w niewielkich stężeniach wprowadza się do środowiska atraktanty, które przyciągają organizmy które nas interesują ale też pozostałe w otoczeniu) -wstępna obróbka fizyczna lub mechaniczna próbki (np. ekstrakcja, zawieszanie próbki w różnych roztworach - wzbogacanie próbki w interesujące nas drobnustroje) -hodowla wzbogajająca - w wyniku której w medium hodowlanym zwiększona liczba organizmów o które nam chodzi, sprzyja wzrostowi bakterii które nas interesują, hamują wzrost tych których nie chcemy np. czynnik selekcjonujący to skład podłoża - dobry dobór podłoża!!! ogólnie: czynnik selekcyjny - skutek: zmiana liczebności populacji w próbce podczas hodowli w określonych warunkach np. związek chemiczny lub warunki prowadzenia hodowli np. termiczne temperatura inkubacji (organizmy termofilne - zmiany temperatury), pH pożywki itp. Potrzeba info na co nasze hodowane organizmy są wrażliwe oraz co sprzyja ich wzrostowi. Dobre dobranie czynników selekcyjnych wiąże się z dużą liczbą eksperymentów. 4

Hodowla wzbogacająca z zastosowaniem podłóż wzbogacających: 1) pobranie próbki środowiskowej 2) inkubacja w pożywce zawierającej czynnik selekcyjny 3) posiew Czynniki selekcyjne - przykłady poszukiwany organizm

czynnik selekcyjny/dodatki do pożywek

zahamowanie wzrostu

-promieniowce

-nowobiocyna, penicylina G, cykloheksymid propionian sodowy

-bakterie i grzyby -inne poza prom.

-bakterie

-nystatyna, cykloheksamid -alkalizacja (CaCO3, inkubacja 7-9dób)

-grzyby -bakterie, promieniowce, grzyby -bakterie przetrwal.

-grzyby -grzyby

-streptomycyna, tetracyklina

-bakterie*

-penicylina, D-cykloseryna, polimyksyna

-Gram + -Gram - **

-1-2 min ogrzanie próbki do 100

-wszystkie inne***

*Wśród bakterii są oporne na antybiotyki, nie wyeliminujemy wszystkich! **W obrębnie podobnej grupy organizmów możliwa jest selekcja *** bakterie archeony - na nich 100 nie robi wrażenia,nie wyelimunujemy ich. Przykład : IZOLACJA BAKTERII PROPIONOWYCH Propionibacterium sp. : -laseczki Gram+ -względnie beztlenowe -metabolizują kwas mlekowy - wykorzystują go jako jedyne źródło węgla - wyjątkowy przypadek -czynniki selekcyjne : brak tlenu, kwas mlekowy jako jedyne źródło węgla organicznego -efekt : brak tlenu a obecna glukoza - izolujemy Streptococcus i Lactobacillus brak tlenu a obecny kwas mlekowy - izolujemy Propinibacterium sp. Techniki izolacyjne - izolowanie producentów Izolowanie producentów - zastosowanie pożywek stałych (zawężamy grupę organizmów nas interesujących) np. enzymów - pożywka selekcyjna z substratem dla enzymu; obserwacja podłoża i kolonii. problem: detekcja (wizualizacja) Izolacja poprzez przegląd szczepów - zastosowanie różnych podłoży hodowlanych -podłoża hodowlane dla maksymalnej ekspresji cech genetycznych -metody wyboru podłoża: 5

*testuje się wiele pożywek o różnych czynnikach limitujących wzrost niepożądanych drobnoustrojów *dla każdego czynnika selekcyjnego - różne formy składników występujących w dostatecznych ilościach. Trzeba dobrać optymalne podłoże do hodowli naszego organizmu. *unika się łatwo przyswajalnych źródeł C i N Test selekcyjny - poszukiwanie producenta -Główna metoda pozyskiwania mikroorganizmów przemysłowych -kryterium: cecha biochemiczna powiązana bezpośrednio lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmu do produkcji danego bioproduktu. -dobre testy selekcyjne : prosta i szybka identyfikacja mikroorganizmó o poszukiwanych cechach, tanie. Izolowanie czystej kultury - izolant Testy fermentacyjne - niewielkie bioreaktory o pojemności 5-20L Ocena przydatności przemysłowej izolantów cel: wybór izolanta prowadzącego określony proces biotechnologiczny z największą wydajnością po uwzględnieniukosztów. -ustalenie optymalnej metody hodowli badanego mikroorganizmu: *rozwiązanie konstrukcyjne bioreaktora *sposób hodowli (ciągła, dolewowa,okresowa) *warunki fizyko-chemiczne hodowli *skład pożywki hodowlanej Identyfikacja Wybrane na podstawie testów fermentacyjnych mikroorganizmy są identyfikowane - identyfikacja taksonomiczna. Identyfikacja mikroorganizmów Pełna informacja o stanie mikroflory danego środowiska czyli: -ile? -jakie? Proces identyfikacji -określenie przynależności do podstawowej jednostki taksonomicznej - gatunku. szczep referencyjny - izolant gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej scharakteryzowany (wzorzec). gatunek - grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70% homologii pełnego genomowego DNA. identyfikacja taksonomiczna bakterii - gatunek to grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej niż o 3% molowe. W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%. metody identyfikacji: *klasyczne (m.in. morfologia komórki, inkluzje komórkowe, wymagania pokarmowe, pigmenty, stosunek do tlenu, patogenność, badania biochemiczne itp) *nowoczesne (analiza ilościowa kwasów nukleinowyc (% G+C), homologia kwasów nukleinowych) 6

-metody biochemiczne: określenie zdolności: *asymilacji (przyswajania) *fermentacji *rozkładu względem określonych związków chemicznych Cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych zachodzących w odpowiedich pożywkach wzrostowych. Wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo: -wzrost lub brak -zmiana zabarwienia pożywki -reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem -wytworzenie gazu Metody biofizyczna: Oznaczanie poprzez identyfikacje: -produktów metabolizmu -wybranych składników struktury np. elektroforeza, chromatografia gazowa Skład białek (jakościowy i ilościowy) charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej. Izolacja białek, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym - oznaczenie profilu białkowego. Skład kwasów tłuszczowych zawartych w komórce (jakościowy i ilościowy) jest charakterystyczny dla danego gatunku przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli - przykład wykorzystania chromatografii gazowej. jakościowa - obecność kw. tłuszczowych, ilościowa - zawartość poszczególnych kw. tłuszczowych Metody biologii molekularnej : -oparte na badaniu homologii kwasów nukleinowych: *sonda genetyczna - jednoniciowy fragment DNA zawierający sekwencje unikalne dla organizmu, znakowana dla detekcji (genomowe, rybosomowe) *FISH-hybrydyzacja fluorescencyjna in situ - wewnątrz komórki bakterynej - w miejscu gdzie występuje badana struktura - genomowe DNA i 16S rRNA (sondy Trak - znakowana peroksydazą chrzanową, sonda Probe znakowana estrem akrydynowym). WYKŁAD 3 Metody immunologiczne -Przeciwciało jako antygen lub jego elementy -Testy aglutynacyjne dla bakterii chorobotwórczych – patogennych, opracowane dla bakterii Staphylococcus auresus (kulki lateksowe po dodaniu antygenu ulegają sieciowaniu w duże kompleksy).

7

Zasada działania testów aglutynacji

-Testy immunofluorescencyjne wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami, które są przyłączone kowalencyjnie, wykorzystywane barwniki FITC (izotiocyjan fluoresceiny, po wzbudzeniu emituje światło zielone) i TRITC (izotrjocyjanian, po wzbudzeniu emituje kolor czerwony), mamy wynik bardzo szybko -Testy immunoenzymatyczne – wizualizacja wyniku z wykorzystaniem barwnego produktu, który powstaje po reakcji enzymatycznej, a enzym jest przyłączony do przeciwciała kowalencyjnie, enzymem jest najczęściej peroksydaza chrzanowa, do wizualizacji wyniku musimy mieć także substrat do tego enzymu; najczęściej peroksydaza chrzanowa (HRP). immunoglobulina z cząsteczką enzymu:

Mikroorganizmy w biotechnologii – doskonalenie szczepów Polepszenie szczepów uwzględnia: -Zwiększenie wydajności wytwarzania określonego czynnika w danym procesie biologicznym -Zachowanie produkcyjności -Odporność na fagi -Problem pienienia – zmiana szczepu, aby nie wytwarzał związków, które mogą pienić się -Odporność na składniki medium hodowlanych -Brak ubocznych produktów przemian Poprzez mutacje -Wywołanie mutacji -Analogi zasad (5-bromouracyl! – sposób działania) 8

-Promieniowanie ultrafioletowe – sposób działania -Selekcja i ocena mutantów Wykorzystanie mutantów – wskaźniki mikrobiologiczne -Szukanie producentów antybiotyków oraz witamin -Przykład - zastosowanie auksotrofów (mutanty metaboliczne, które w wyniku mutacji zatraciły zdolność syntezy jakiś aminokwasów/ związków) -Podłoże ze szczepem wskaźnikowym – potrzebuje aminokwasów do wzrostu

Zastosowanie mutantów w przemyśle -Zwiększona produkcja penicyliny – wyprowadzony z dzikiego szczepu Penicillium chrysogenum Q-176 w przemyśle od 1945r. – badania przesiewowe -Zwiększona produkcja L-lizyny – Corynebacterium glutamicum – 30% wydajności, 2 typy mutantów: -Wyeliminowanie dehydrogenazy homoserynowej – mutanty nie produkują tego białka -Zmiana właściwości kinazy asparaginowej (nie jest hamowana przez produkt L-Lys) – mutanty mają

9

zmianę tej kinazy

Doskonalenie szczepów – hybrydyzacja -Naturalna hybrydyzacja – przekazanie informacji genetycznej od dawcy do biorcy w wyniku ich fizycznego kontaktu – wymiana fragmentów DNACzęstotliwość 10-6 -Zachodzą w obrębie gatunku -Przeszkody - Sztywna ściana komórkowa, ujemny potencjał po zewnętrznej stronie błony

10

komórkowej, fuzja protoplastów – hybrydyzacja wymuszona najłatwiej u zwierząt -Musi występować cykl płciowy lub cykl paraseklsualny – możliwość rekombinacji Hybrydyzacja -Protoplasty bakterii gram(+) – lizozym -Protoplasty bakterii gram(-) – lizoym + EDTA + warunki jonowe -Protoplasty grzybów – sok żołądkowy ślimaka Helix pomatia, enzymy lityczne pochodzenia drobnoustrojowego Najłatwiej otrzymać protoplasty z komórek pochodzących z fazy wzrostu wykładniczego. Stabilizacja środowiska osomotycznego – sole mineralne, sacharydy, bufory (fosforanowy, fosforanowo-malinowy, fosforanowo-cytrynianowy) *Protoplasty łączenie odległość mniejsza niż 1mm, poprzez PEG – inicjator fuzji adhezja komórek Hybrydyzacja -Fuzja – układ heterokariotyczny – zachodzi kariogamia i rekombinacja pomiędzy genoforami -Haploidyzacja – samorzutna lub indukowana (Benomyl – związek chemiczny, który blokuje powstanie prawidłowej komórki i dochodzi do jej rozpadu) -Segregacja nowych genotypów -Hodowla protoplastów w odpowiedniej pożywce -Selekcja rekombinantów – wymaga genetycznie trwałych markerów fizjologicznych (np. auksotrofii, mutantów oddechowych lub opornych antybiotyk) -Fuzja protoplastów umożliwia rekombinację wewnątrzgatunkową oraz zewnątrzgatunkową więcej niż dwóch genotypów Technologie rekombinacji DNA -Przenoszenie konkretnych genów z jednego organizmu do drugiego i otrzymanie klonów komórek – syntezują nowe białko -Mamy zdefiniowane geny i przenosimy ten fragment do innego organizmu -Na przykład – klonowanie etapy: 1)Izolacja lub synteza genu 2)Łączenie genu z wektorem 3)Wprowadzenie do komórki gospodarza 4)Selekcja klonów 5)Praktyczne wykorzystanie klonów Wykorzystanie zrekombinowanych szczepów w biotechnologii Z roku na rok coraz większa zachorowalność na cukrzycę Insulina wieprzowa od ludzkiej różni się tym, ze w insulinie wieprzowej na 14 pozycji nie ma alaniny, a o obniża jej aktywność Humulin – pierwszy lek uzyskany drogą inżynierii genetycznej wprowadzony do lecznictwa Gensulin – pierwszy polski lek, wyprodukowany przy zastosowaniu inżynierii genetycznej

Mikroflora surowców i produktów pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego Surowiec/Produkt Skład chemiczny

Czynniki środowiskowe

Oddziaływania miedzy 11

Białka Tłuszcze Węglowodany Kwasy organiczne Witaminy

Aktywność wody Temperatura Tlen Wilgotność

drobnoustrojami Bezpośrednie Pośrednie

Surowce i produkty pochodzenia roślinnego *Źródła mikroflory -Gleba, powietrze, woda, organizmy żywe -Mikroorganizmy glebowe – bakterie przetrwalnikujące Bacillus sp. i Clostridium sp., promieniowce, drożdże, pleśnie -Rośliny okopowe -105-108 komórek drobnoustrojów/gram *Cechy -Mikroflora saprofityczna, patogeny roślin nieszkodliwe dla ludzi oraz patogeny ludzi i zwierząt (Listeria monocytogenes, Clostrdium botulinium, Yersina enetrocolitica i E.coli) -Różny rodzaj i liczebność mikroflory WYKŁAD IV Surowce i produkty pochodzenia roślinnego Ziarna zbóż i produkty zbożowe •

Mikroorganizmy pochodzenia glebowego

•

Mikroflora epifityczna – pałeczki Psedumonas sp., Erwinia herbicola pleśnie – Alternaria sp., Clasdosporium sp., Trichoderma sp., drożdże, Geotrichum sp.

•

Mikroflora wtórna – bakterie fermentacji mlekowej (BFM), tlenowe bakterie przetrwalnikujące, bakterie z grupy coli, ziarniaki: Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Sarcina sp., pleśnie: Aspergillus sp., Penicillium sp., Fusarium sp.

•
...