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INTRODUCCIÓN La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre, y una de las más abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hígado. La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de huevo). Pertenece a la superfamilia proteínica de las serpinas, aunque a diferencia de la mayoría de éstas la ovoalbúmina no es capaz de inhibir cualquier peptidasa. Para la identificación cualitativa de la presencia de proteínas a partir de la clara de huevo se emplean sustancias que reaccionan específicamente. Algunas de las muestras utilizadas fueron: huevo de gallina y de codornis, y algunos elementos necesarios para su determinación.

OBJETIVOS  Extraer la ovoalbúmina a partir de la clara de huevo y reconocer sus propiedades.  Identificar la proteína por el método de biuret.  Determinar en qué consiste la desnaturalización de una proteína.

MARCO TEÓRICO  ¿QUÉ ES LA ALBÚMINA?

La albúmina es una proteína que se encuentra en gran proporción en el plasma sanguíneo, siendo la principal proteína de la sangre, y una de las más abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hígado. La albúmina es fundamental para el mantenimiento de la presión oncótica, necesaria para la distribución correcta de los líquidos corporales entre el compartimento intravascular y el extravascular, localizado entre los tejidos. La albúmina tiene carga eléctrica negativa.

 FUNCIONES DE LA ALBÚMINA Mantenimiento de la presión oncótica. Transporte de hormonas tiroideas. Transporte de hormonas liposolubles. Transporte de ácidos grasos libres. Transporte de bilirrubina no conjugada. Transporte de muchos fármacos y drogas. Unión competitiva con iones de calcio. Control del pH. Funciona como un transportador de la sangre. Regulador de líquidos extracelulares.

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 TIPOS DE ALBÚMINA   

Seroalbúmina: Es la proteína del suero sanguíneo. Ovoalbúmina: Es la albúmina de la clara del huevo. Lactoalbúmina: Es la albúmina de la leche.

 ¿QUÉ ES LA OVOALBÚMINA? La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo. Esta proteína se desnaturaliza fácilmente al agitar la clara. Además es la proteína de mayor valor biológico ya que tiene muchos de los nueve aminoácidos esenciales. Es llamada fosfoglucoproteína integrada por tres fracciones, A1, A2 y A3. Es rica en cisteína y metionina y presenta grupos sulfhidrilos y se puede decir que la presencia de estos grupos sulfhidrilos hace una gran contribución aparte del sabor, textura y aroma característicos del huevo. La ovoalbúmina de los huevos de gallina posee cerca de 385 aminoácidos, y poseen una masa molecular relativa de 45 kDa. Se trata de una glicoproteína con cuatro posiciones de glicoestación.

 ESTRUCTURA DE LA OVOALBÚMINA La proteína ovoalbúmina de pollos se compone de 385 aminoácidos y su masa molecular relativa es 45 kDa. Ovoalbúmina también tiene varias modificaciones, como la acetilación N-terminal, fosforilación, glicosilación.

 ALIMENTOS RICOS EN PROTEÍNAS

Tenemos a la leche, huevo, queso, carne de res o ternera, carnes magras, semillas de zapallo o sandia, marmite, langostas, mariscos, huevo, etc.

 ¿EN QUÉ CONSISTE LA DESNATURALIZACIÓN DE UNA PROTEÍNA? La desnaturalización es una propiedad de la proteína, se refiere a la ruptura de los enlaces que mantenían sus estructuras cuaternarias, terciarias y secundarias, conservándose solamente la primaria. La mayoría de las proteínas experimentan desnaturalización cuando se calientan entre 50º y 60º C, y otras cuando se enfrían por debajo de los 10º y 15º C.

 BUFFER FOSFATO DE pH7 Ejerce su acción fundamentalmente a nivel intracelular, ya que es allí donde existe una mayor concentración de fosfatos y el pH es más próximo a su pK (6.8).Interviene, junto a las proteínas celulares de manera importante en la amortiguación de los ácidos fijos: PO.

 ACIDO SULFÚRICO La molécula presenta una estructura piramidal, con el átomo de azufre en el centro y los cuatro átomos de oxígeno en los vértices. Los dos átomos de hidrógeno están unidos a los átomos de oxígeno no unidos por enlace doble al azufre. Dependiendo de la disolución, estos hidrógenos se pueden disociar. En agua se comporta como un ácido fuerte en su primera disociación, dando el anión hidrogenosulfato, y como un ácido débil en la segunda, dando el anión sulfato. Además reacciona violentamente con agua y compuestos orgánicos con desprendimiento de calor.

 HIDROXIDO DE SODIO A temperatura ambiente, el hidróxido de sodio es un sólido blanco cristalino sin olor que absorbe humedad del aire (higroscópico). Es una sustancia manufacturada. Cuando se disuelve en agua o se neutraliza con un ácido libera una gran cantidad de calor que puede ser suficiente como para encender materiales combustibles. El hidróxido de sodio es muy corrosivo. Generalmente se usa en forma sólida o como una solución de 50%.

 ACETONA

Es un compuesto químico de fórmula química CH3(CO)CH3del grupo de las cetonas que se encuentra naturalmente en el medio ambiente. A temperatura ambiente se presenta como un líquido incoloro de olor característico. Se evapora fácilmente, es inflamable y es soluble en agua. La acetona sintetizada se usa en la fabricación de plásticos, fibras, medicamentos y otros productos químicos, así como disolvente de otras sustancias químicas.

 ACETATO DE PLOMO Es un compuesto químico cristalino de color blanco con un sabor ligeramente dulce. Al igual que otros compuestos plúmbeos, es una sustancia muy tóxica. El acetato de plomo es soluble en agua y glicerina. La sustancia se usa como reactivo para generar otros compuestos de plomo y como fijador para algunos tintes. En bajas concentraciones, es el principal ingrediente activo en una variada gama de tinturas progresivas del cabello, que va tomando progresivamente un color castaño debido a la combinación del plomo con el azufre, más abundante en las proteínas del cabello que en las de la piel.

 AGUA DESTILADA

Es aquella cuya composición se basa en la unidad de moléculas de H2O. Es aquella a la que se le han eliminado las impurezas e iones mediante destilación. La destilación es un método en desuso para la producción de agua pura a nivel industrial. Esta consiste en separar los componentes líquidos de una mezcla.

 REACTIVO DE BIURET

El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El hidróxido de potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

 REACCIÓN XANTOPROTEICA La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un alcalino, se torna color amarillo oscuro.

 ACIDO NITRICO El ácido nítrico puro es un líquido viscoso, incoloro e inodoro. A menudo, distintas impurezas lo colorean de amarillo-marrón. A temperatura ambiente libera humos rojos o amarillos. El ácido nítrico concentrado tiñe la piel humana de amarillo al contacto, debido a una reacción con la cisteina presente en la queratina de la piel.

 BAÑO MARÍA

Es un método empleado en las industrias, en laboratorio de química y en la cocina, para conferir temperatura uniforme a una sustancia líquida o sólida o para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en otro mayor con agua que se lleva a o está en ebullición.

MATERIALES Y EQUIPOS

 VASO BEAKER  TUBOS DE ENSAYO  GRADILLA PARA TUBO  GOTERO  ESPÁTULA  PICETA  PROBETA GRADUADA  PIPETAS  AGUA DESTILADA  BUFFER FOSFATO DE pH7  ACIDO SULFÚRICO  HIDRÓXIDO DE SODIO  ACETONA  ACETATO DE PLOMO  RVO. DE BIURET  ACIDO NÍTRICO  EQUIPOS: BALANZA, CENTRIFUGADORA, EQUIPO DE BAÑO MARIA, CAMPANA EXTRACTORA DE GASES  MUESTRA: HUEVO DE GALLINA  LENTES DE SEGURIDAD  GUANTES, MASCARILLA, GORRO DESCARTABLE

PROCEDIMIENTO

1) EXTRACCIÓN DE LA OVOALBÚMINA DE LA CLARA DE HUEVO

a) en un vaso precipitado colocar 2 gramos de clara de huevo.

b) luego agregar 20 o 30ml de buffer fosfato de pH7 y lo vaciamos en un tubo para colocarlo en la centrifugadora a 3500 rpm x 5 min.

2) DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

a) CON CALOR En un tubo colocar 1ml del sobrenadante, luego colocarlo en baño maría a 42ºC x 10min. Observar e interpretar.

b) EN MEDIO ÁCIDO En un tubo colocar 1ml del sobrenadante, luego agregar 1ml de ácido sulfúrico. Agitar y observar e interpretar.

c) EN MEDIO BASE En un tubo colocar 1ml del sobrenadante, luego agregar 1ml de hidróxido de sodio. Agitar y observar e interpretar. c) luego separar el sobrenadante (ovoalbúmina) en los tubos de ensayo para el segundo procedimiento. d) CON DISOLVENTE ORGÁNICO En un tubo colocar 1ml del sobrenadante, luego agregar 2ml de acetona. Agitar y observar e interpretar.

e) CON CATIONES PESADOS En un tubo colocar 1ml del sobrenadante, luego agregar 1ml de acetato de plomo. Agitar y observar e interpretar.

3) IDENTIFICACIÓN POR EL MÉTODO DE BIURET

a) en un tubo agregar 2ml de agua destilada y 3ml del Rvo. de biuret.

b) en otro tubo agregar 1.8ml de agua destilada, 0.2ml del sobrenadante y 3ml del Rvo. de biuret.

4) REACCIÓN XANTOPROTEICA

a) en un tubo agregar 1ml del sobrenadante y 1ml de ácido nítrico. Agitar y observar.

b) luego agregar 5 gotas de hidróxido de sodio al 10%. Observar e interpretar.

c) en otro tubo agregar 1ml de agua destilada, 1ml del sobrenadante y 3ml del Rvo. de biuret.

d) en otro tubo agregar 2ml del sobrenadante y 3ml del Rvo. de biuret.

e) después agitamos cada tubo y esperamos 10 segundos. Observamos la aparición del color característico.

RESULTADOS

 Una vez realizado los procedimientos obtuvimos como resultado del primer procedimiento: se logró separar la ovoalbúmina de la clara de huevo.  En el segundo procedimiento: el primer tubo tiene pequeños fragmentos de la ovoalbúmina y el color es un poco blanco. El segundo tubo cambió a un color rojizo, la Tº aumentó y se observa pequeñas partículas. El tercer tubo mantuvo un color transparente, observando en la superficie burbujas y pequeñas partículas. El cuarto tubo cambió a un color casi blanco. El quinto tubo cambió a un color lechoso totalmente.  En el tercer procedimiento: el primer tubo no cambió de color, se quedó en el color del reactivo un color turquesa. El segundo tubo cambió a un color violeta claro. El tercer tubo cambió de color a violeta. El cuarto tuvo cambió de color a violeta mas oscuro.  En el cuarto procedimiento el contenido del tubo cambió a un color amarillo un poco oscuro y desprendió un gas con olor a combustible.

DISCUSIÓN Z Z

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Del primer procedimiento: se pudo extraer la ovoalbúmina de la clara de huevo, por el buffer fosfato de pH7 ya que tiene un comportamiento anfótero capaz de neutralizar las variaciones de pH del medio. Del segundo procedimiento: con el calor: cuando la temperatura aumenta destruye los enlaces cuaternarios, terciarios y secundarios, conservando la estructura primaria, lo que la desnaturaliza presentando un color blanco. En medio ácido cambia de color y se desnaturaliza ya que en su estructura este presenta un grupo amino. En medio base el color es trasparente y se desnaturaliza por que en su estructura presenta un grupo carboxilo. Con disolvente orgánico este rompe los enlaces disulfuros y al desnaturalizarlos cambian a color blanco. Con cationes pesados al desnaturalizarlos este cambia a color lechoso. Del tercer procedimiento: en el primer tubo no cambio al color violeta por que no había presencia de proteína. En el segundo, tercer y cuarto tubo cambio al color característico violeta por que si había presencia de proteínas y el reactivo tiñó sus enlaces. Del cuarto procedimiento: el acido nítrico indica la presencia de proteínas en una solución, en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos y al mezclarlo con un alcalino cambio de color a amarillo oscuro.

CONCLUSIÓN

Gracias a la realización de esta práctica se pudo identificar la proteína en este caso la ovoalbúmina que está en la clara de huevo, reconociendo sus propiedades uno de ellos es la desnaturalización mediante calor, con un reactivo ácido, base, a través de disolventes orgánicos o cationes pesados. Otra propiedad es su capacidad amortiguadora teniendo un comportamiento anfótero (ácido/base). Además se identificó fácilmente por el método de biuret al teñir la muestra con un color característico.

BIBLIOGRAFÍA Recursos del tema se pueden encontrar en: http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/chang Denniston, Topping and Caret (2004). General, Organic, and Biochemistry , 4ta Ed. McGraw Hill. New York. USA Boyer, B (1999).Concepts in Biochemistry, Brooks/Cole Publishing. http://employees.csbsju.edu/ssaupe/biol115/chem_bi ol.htm Solomon, Berg & Martin (2004). Biology, 7th Ed. Brooks Cole Publ....