Laboratorium kultur in vitro. Podłoża hodowlane. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 2. Laboratorium kultur in vitro. hodowlane. 1. i zasady pracy w laboratorium kultur in vitro. Laboratorium kultur in vitro musi przynajmniej z trzech oddzielnych a z nich ma etapowi i prowadzenia kultur: pomieszczenie przygotowania i sterylizacji miejsca pracy, oraz pomieszcze...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 2. Laboratorium kultur in vitro. Podłoża hodowlane. 1. Wyposażenie i zasady pracy w laboratorium roślinnych kultur in vitro. Laboratorium kultur in vitro musi składać się przynajmniej z trzech oddzielnych pomieszczeń, a każde z nich ma służyć odrębnemu etapowi zakładania i prowadzenia kultur: • pomieszczenie przygotowania pożywek i sterylizacji (pożywek, miejsca pracy, narzędzi oraz roślin); • pomieszczenie z komorą laminarną do pracy sterylnej; • pomieszczenie hodowli roślin. Przygotowanie pożywek wymaga: • podstawowego sprzętu laboratoryjnego w postaci: o szkoła laboratoryjnego; o wagi; o pH-metru; o mieszadła magnetycznego; • podstawowych składników pożywek: o soli jako źródła makro- i mikroelementów; o witamin; o cukru; o agaru; o regulatorów wzrostu; o wody dejonizowanej; • autoklawu parowego lub mikrofalowego służącego do sterylizacji, który jest szybszy, ale sterylizuje mniejsze ilości materiału. Naczynia hodowlane mogą stanowić każde, odpowiednio przygotowane, wysterylizowane i spełniające wymagania pojemniki szklane lub plastikowe np.: słoiki, pudełka (różnego pochodzenia), zlewki, probówki, szalki z przezroczystymi lub nieprzepuszczającymi światła wieczkami. Komora laminarna – wyposażone w filtr HEPA urządzenie wykorzystywane do pracy laboratoryjnej w warunkach sterylnych z laminarnym przepływem powietrza i możliwością sterylizacji promieniowaniem ultrafioletowym. Komory laminarne można podzielić ze względu na klasy bezpieczeństwa: • I, II – stanowią komory otwarte, w których powietrze po przejściu przez filtr HEPA i całą komorę w końcu wylatuje na zewnątrz: o w klasie I powietrze to wydostaje się na zewnątrz, w klasie II powietrze zostaje recyklowane w środku; • III – stanowi komora zamknięta, która służy do pracy z bardzo niebezpiecznymi organizmami lub substancjami (nie dotyczy roślin). W odpowiednio przygotowanej komorze laminarnej powinny znaleźć się sterylne: narzędzia, szkła i plastiki (np. końcówki do pipet), palnik, naczynia hodowlane i pożywki, pipety, etanol do sterylizacji narzędzi, środki do dezynfekcji powierzchni, rąk oraz przedmiotów „z zewnątrz”, a także pisaki, statywy i parafilm. Sterylizacja laminaru polega na wstępnej dezynfekcji powierzchni płaskich etanolem a następnie wystawienia całej komory na działanie promieniowania UV przez około 20 minut. Po zakończonej pracy w komorze laminarnej przygotowane hodowle umieszcza się w fitotronach lub komorach hodowlanych (charakteryzujących się bardziej kontrolowanymi warunkami).

2. Charakterystyka składu pożywek hodowlanych – składniki obligatoryjne. Obowiązkowymi składnikami, które muszą znajdować się we wszystkich pożywkach hodowlanych są: • woda; • sole (makro- i mikroelementy); • witamina B1 (tiamina, reszta witamin nie jest niezbędna). Opcjonalnymi dodatkami są: • cukier jako dodatkowe źródło węgla; • hormony i regulatory wzrostu; • mieszaniny związków organicznych o niezdefiniowanym składzie; • substancje bakterio- i grzybobójcze; • substancja żelująca. Należy pamiętać, że skład pożywki zawsze ulega zmianie w trakcie sterylizacji w wyniku działania wysokiej temperatury i promieniowania UV, ale także podczas przechowywania i hodowli ze względu na fakt, że roślina w trakcie swojego wzrostu wydziela różne substancje do podłoża! Składniki mineralne pobierane są przez rośliny z gleby w formie jonów głównie przez korzeń na zasadzie transportu aktywnego lub biernego i jest to zależne od obecności innych jonów, temperatury, pH oraz stanu fizjologicznego komórki. W kulturach in vitro pobieranie tych składników zachodzi przez powierzchnię cięcia eksplantatu, epidermę, a także aparaty szparkowe (ograniczona transpiracja powoduje spowolnienie tego transportu ze względu na zamknięcie aparatów). Sole zawarte w pożywkach powinny dostarczać: • makroelementów, które tworzą ponad 0,1% suchej masy roślin i w pożywkach występują w stężeniu 0,5 M: o azot (7N): § składnik m.in. białek, kwasów nukleinowych i chlorofilu; § pobierany w formie NO3- lub NH4+ lub aminokwasów (np. hydrolizat kazeiny); • jony amonowe mogą być bezpośrednio wykorzystywane do syntezy związków organicznych, ale w wyższych stężeniach są toksyczne, powodują witryfikację roślin oraz zakwaszenie podłoża hodowlanego; o potas (K+): § w formie kationu nie jest metabolizowany w roślinach; § reguluje potencjał osmotyczny, odczyn oraz turgor komórek (jest odpowiedzialny m.in. za ruchy aparatów szparkowych); § kofaktor enzymów; § jego niedobór powoduje witryfikację oraz upośledzenie pobierania fosforanów; o fosfor (H2PO4-, HPO42-): § składnik fosfolipidów, kwasów nukleinowych, koenzymów, związków wysokoenergetycznych (ATP); § najszybciej pobierany składnik mineralny charakteryzujący się wolną dyfuzją w stałych pożywkach; o siarka (SO42-): § składnik białek (cysteina, metionina) i innych związków organicznych; § ligand wiążący jony metali; o wapń (Ca2+): § pełni funkcje strukturalne (np. tworzy blaszkę środkową ściany komórkowej); § wtórny przekaźnik sygnału;

§ § §

kofaktor enzymów; niska mobilność; niedobór wapnia powoduje zahamowanie wzrostu oraz nekrozę wierzchołków; § jego niska rozpuszczalność powoduje ograniczoną możliwość zwiększenia stężenia w pożywce; o magnez (Mg2+): § składnik chlorofilu oraz enzymów; § wysoka mobilność; § umożliwia utrzymanie równowagi jonowej;

Rysunek 1. Witryfikacja (B i C) – inaczej szklistość, czyli hiperuwodnienie tkanek powodujące zmiany struktury mezofilu, aparatów szparkowych i kutykuli roślin w hodowlach in vitro.

mikroelementów, których zawartość w roślinach jest ponad 1000 razy mniejsza (0,01% i mniej) niż makroelementów, ale większa niż w przypadków korzystnych pierwiastków śladowych (Co, Na, Si, Al, V): o żelazo (Fe2+, Fe3+): § pobierany i transportowany wyłącznie w formie kationów dwuwartościowych; § w pożywce dostępny wyłącznie w postaci soli kompleksowych (chelatów) z EDTA; § jego dostępność zwiększa się wraz z wydzielaniem przez rośliny kwasów organicznych do pożywki (kwas maleinowy lub cytrynowy); § składnik enzymów odpowiedzialnych za transport elektronów; o molibden (MoO42-): § składnik reduktazy azotanowej; § wpływa na pobieranie azotu z pożywki; o bor (H2BO3, BO33-, B4O72-): § rola w funkcjonowaniu błon oraz struktury ścian komórkowych; § wpływa na rozwój zarodków somatycznych (korzeni i pędów); o chlor (Cl-): § wymagany do fotolizy wody w PSII; § regulacja osmotyczna; § jego nadmiar w pożywce powoduje witryfikację. Zanieczyszczenia zawarte w agarze mogą stanowić dodatkowe źródło składników mineralnych (zwłaszcza mikroelementów)! Odczyn pożywki znacząco wpływa na pobieranie składników mineralnych przez roślinę in vitro i zmienia się on w trakcie autoklawowania. Dla większości roślin pH pożywki powinno zawierać się w przedziale od 5,6 do 5,8 1. W przypadku paproci, storczyków oraz wrzosowatych wartość ta jest niższa: od 4,5 do 5,3. •

1

odczyn cytoplazmy komórki roślinnej: od 6,7 do 7,7; odczyn wakuol: od 4 do 6.

3. Charakterystyka składu pożywek hodowlanych – składniki dodatkowe. Tiamina (witamina B1) jest jedyną witaminą, która jest niezbędna dla roślin w pożywkach. Innymi, nieobligatoryjnymi witaminami, które często wykorzystywane są w modyfikacjach podstawowych pożywek np. do hodowli protoplastów są: • A (retinol); • B2 (ryboflawina); • B3 (kwas nikotynowy); • B5 (kwas pantotenowy); • B6 (pirydoksyna); • H lub B7 (biotyna); • B9 (kwas foliowy); • B10 (kwas aminobenzoesowy); • B12 (kobalamina); • C (kwas askorbinowy); • D (kalcyferole). Dodatkowymi składnikami są również aminokwasy (glicyna, kwas glutaminowy, glutamina) przyspieszające wzrost, przeciwutleniacze (kwas askorbinowy, cysteina) oraz mio-inozytol – cykliczny alkohol, który bierze udział w budowie ścian komórkowych oraz przekazywaniu sygnałów komórkowych (w tym hormonalnych). Najczęściej stosowaną pożywką w kulturach in vitro jest przepisu Murashige-Skooga (MS), lecz wykorzystywane są także pożywki: • Gamborg B5; • White; • Knop; • Woody Plant Medium; • Hoagland; • Schenk & Hildebrant; • Murashige-Millera (zawierającej mio-inozytol oraz tiaminę). Cukry – dodawane do podłoży hodowlanych jako substraty energetyczne mające wspomagać proces fotosyntezy roślin w kulturach in vitro. Odpowiadają także za regulację potencjału osmotycznego komórek, a przez to – dostępność wody: • sacharoza – najczęściej stosowany dwucukier (1-5%) w pożywkach typowych, w wyższych stężeniach wykorzystuje się ją do hodowli zarodków somatycznych, androgenezy i gynogenezy: o jest podstawową formą transportu cukrów w roślinach; o podczas autoklawowania częściowo zostaje hydrolizowana do glukozy i fruktozy; • glukoza – wykluczona w hodowlach wyprowadzanych z nasion, ponieważ hamuje kiełkowanie; • fruktoza; • galaktoza; • laktoza; • mannoza. Obecność cukrów w pożywce sprzyja zakażeniom, jednak odgrywają one ważną rolę metaboliczną oraz sygnałową: w trakcie rozwoju rośliny transportowane są z fotosyntetyzujących liści do organów pobierających takich jak korzenie, merystemy, młode liście, kwiaty, owoce czy zawiązujące się nasiona. Obniżone (L) poziomy cukru w tkankach mogą powodować zwiększenie aktywności wytwarzającej: fotosyntezy, metabolizmu składników odżywczych czy eksportu. Z drugiej strony wyższe (H) stężenia cukrów w tkankach

je pobierających inicjują wzrost oraz procesy prowadzące do magazynowania substancji zapasowych. Akumulacja wysokiego poziomu cukrów w tkankach wytwarzających prawdopodobnie prowadzi do obniżania poziomu fotosyntezy w celu utrzymania homeostazy. Ta aktywność pozwala na adaptację metabolizmu węgla do zmieniających się warunków środowiska i dostępności składników odżywczych.

Rysunek 2. Różnice efektów cukrów na roślinną aktywność sink (wykorzystywania) oraz source (wytwarzania).

Sensorami cukrów w komórkach roślinnych, umożliwiających przekazywanie sygnałów są: • heksokinaza – rola katalityczna (glikoliza) i sygnałowa (sensor glukozy); • transporter sacharozy (SUT2); • kinazy SnRK1 i TOR – pełnią przeciwstawne funkcje w zależności od dostępności cukru, wpływają na ekspresję genów: o “głodu” (aktywowane w warunkach niedoboru cukru, co powoduje zwiększenie intensywności fotosyntezy) i “sytości” (stymulacja procesów, w których energia jest wykorzystywana); o trehalozo-6-fosforanu – ważna cząsteczka sygnałowa. Cukry niejednoznacznie wpływają na proces fotosyntezy w kulturach in vitro. W zależności od wielu czynników mogą powodować jej dalsze hamowanie lub wzrost fotosyntezy i fotoprotekcję (ochrona aparatu fotosyntetycznego przez zbyt dużym natężeniem światła). Głównymi hormonami wzrostu wykorzystywanymi w hodowlach in vitro są auksyny (IAA) i cytokininy (BAP), których wzajemny stosunek decyduje o kierunku morfogenezy eksplantatu (w kierunku korzeni [IAA] czy w kierunku pędów [BAP]). Rzadziej używane są gibereliny i kwas abscysynowy, przy czym wykazano, że hormony syntetyczne charakteryzują się większą aktywnością i trwałością. Oprócz czystych hormonów stosuje się także inhibitory i substancje modyfikujące działanie hormonów np. inhibitory polarnego transportu auksyn.

Do pożywek dodawane są również: • substancje naturalne o niezidentyfikowanym składzie, które są jednak coraz rzadziej stosowane, wyłącznie dla kultur bardzo wrażliwych z dużym zapotrzebowaniem na hormony i substancje odżywcze. Obecnie odchodzi się od tych substancji, ze względu na poznaną ich naturę i skład: o hydrolizat kazeiny; o pepton; o ekstrakt drożdżowy; o mleczko kokosowe; o sok pomidorowy; o proszek bananowy; • substancje o działaniu bakteriobójczym i grzybobójczym: o antybiotyki; o substancje grzybobójcze; o PPM (ang. Plant Preservative Mixture) – inhibitory szeregu kluczowych enzymów bakterii i grzybów, posiada jednak dwie wady: § wysoka cena; § brak dokładnego opisania efektów tego środka na tkanki roślinne. • substancje żelujące: o agar (0,5-1%) – polisacharyd otrzymywany z krasnorostów (Gelidium, Gracilaria) zbudowany z agarozy i agaropektyny, który może zawierać zanieczyszczenia hamujące wzrost niektórych kultur; o agaroza; o κ-karagen – pozyskiwany z krasnorostów; o Phytagel – polimer zbudowany z reszt glukozy, ramnozy i kwasu glukuronowego otrzymywanych z bakterii; o Agargel – mieszanina agaru oraz Phytagelu; o Gelrite (guma gellan) – polimer uzyskiwany z bakterii Pseudomonas elodea.

Rysunek 3. Zachowanie cząsteczek agaru podczas przygotowywania pożywek hodowlanych.

4. Inne sposoby prowadzenia hodowli roślinnych. Najczęstszymi alternatywami dla pożywek stałych są płynne pożywki, w których rezygnuje się z dodawania substancji żelującej. Takie podłoża wykorzystywane są do hodowli: • zawiesinowych; • roślin wodnych;

• mikroglonów i sinic; • bioreaktorów (hodowle tkankowe lub komórkowe); • androgenezy i gynogenezy. Kolejnymi metodami są bezglebowe uprawy roślin: • uprawa hydroponiczna; • cienkowarstwowa kultura przepływowa; • uprawa aeroponiczna; • uprawa przypływ-odpływ (ang. temporary immersion system): o mniejszy nakład pracy; o regularne przewietrzenie hodowli; o możliwość wymiany pożywki; o lepsza adaptacja roślin ex vitro.

Rysunek 4. Charakterystyka bezglebowych metod upraw roślin.

Gotowe podłoża do hodowli roślin in vitro można przechowywać około 1 miesiąca w ciemności i chłodzie, aby zapobiec rozpadowi substancji w pożywce. Koniecznie jest dobre zabezpieczenie przed parowaniem, a także przechowywanie w możliwie sterylnych warunkach....