3. Amplification in vitro par PCR PDF

Preview

Summary

Cours niveau L3...

Description

Amp Amplific lific lificat at ation ion in vit vitro ro par PC PCR R I.

Princ rincipe ipe

PCR = Polymerase Chain Reaction Cette méthode permet l’amplification enzymatique d’une séquence donnée d’ADN in vitro. Le positionnement des amorces va définir la séquence qui sera amplifier.

Les amorces sont orientées de façon à ce que : - La synthèse d’ADN survienne dans la région comprise entre les amorces - La synthèse se fasse dans le sens 5’  3’ - L’hybridation soit complémentaire et antiparallèle sur la matrice

L’amplification est exponentielle d’une séquence d’ADN spécifique. Chaque cycle double la quantité d’ADN : si on a n cycles, on aura 2n molécules.

NB1 : Le nombre de cycle n’est pas illimité car on finit toujours par obtenir un plateau du à : - Un épuisement des composants de la réaction - Une compétition entre les amorces et les fragments amplifiés

NB2 : En pratique, au bout de n cycles, le nombre de copies est ≤ 2n. - Le rendement est ≤ 100% - En moyenne, pour 30 cycle : 106 copies mais en théorie 230 = 109

II.

Réalis éalisation ation pr pratiqu atiqu atique e

A connaitre par cœur !

III.

Com Composa posa posants nts ADN – Enzyme – dNTPs – Amorces – [Mg2+] – pH

L’ADN total contient l’ADN cible (= matrice) : - Meilleurs résultats avec l’ADN purifié - Quantité initiale d’ADN à partir de 10 à 100ng d’ADN total L’enzyme : la Taq polymérase. Elle doit être thermostable. - 1 à 2,5 U pour 50 à 100 µl de réaction

NB : Il est nécessaire de séquencer les fragments amplifiés avant une utilisation ultérieure pour vérifier les erreurs potentielles de la taq ! Les désoxynucléotides triphosphates (dNTPs) : plus la concentration est élevée et plus l’ADN pol commet des erreurs ! [dNTPs] = 0,2 mM 2 amorces : Design = étape essentielle ! Séquence : - 15 à 25 dNTPs (ADN) - Pas d’hybridation intra- ou inter- amorces ! - Spécifiques d’un seul gène cible ! Les Tm des amorces doivent être proches l’une de l’autre : Tm = (2 x AT) + (4 x GC)  Choix avec programme bio-informatique (ex : Primer 3…) Ion Mg2+ : ils vont favoriser l’hybridation amorces/cible en stabilisant les charges négatives - Concentration  Facteur critique - [Mg2+] optimale déterminée par tâtonnement : 1 à 2 mM pH : Ex : pour la Taq polymérase = 8,3 ≤ pH ≤ 8,8

IV.

Problè roblèm mes rrenco enco encontr ntr ntrés és

1) Problème crucial : la contamination avec l’ADN étranger due à la puissance de l’amplification PCR !  Contamination inter-échantillons pré-PCR Contamination d’un échantillon négatif par un échantillon positif avant l’amplification (prélèvement, extraction d’ADN, préparation des réactions…)  Contamination des réactifs ou échantillons avec l’ADN amplifié provenant d’amplifications précédentes  Contamination inter-échantillons post-PCR Lors de la détection des produits amplifiés NB : Echantillon positif contient au moins 1000 molécules ADN/µl ! Mesures préventives : Expérience conduite dans 3 labos distincts - Préparation des échantillons d’ADN dans la 1ère pièce (extraction d’ADNg) - Préparation des réactions PCR dans la 2ème pièce (mix PCR et PCR) - Analyse des produits PCR dans la 3ème pièce (gel agarose)  Avec utilisation de pipettes différentes, hottes PCR… Attention : Une fois dans une pièce, on ne revient JAMAIS en arrière ! De nombreux contrôles sont nécessaires avant analyse !

Ex : réaction sans ADN = contrôle négatif ! 2) Manque de fidélité de la Taq polymérase La taq polymérase ne fait pas de « proofreading » : le taux d’erreur est de 10-4 (1 sur 10 000)  Nouvelle enzyme disponible : pfu ADN polymérase - Extraire de Pyrococcus furiosus - Plus stable à chaleur - Activité exonucléase 3’-5’ - Taux d’erreur = 10-6 (1 sur 1 000 000) - Mais plus lente !

3) Amplifications parasites On joue normalement avec des amorces spécifiques. Les amorces vont potentiellement s’hybrider ailleurs et former un autre fragment. Quelque chose qui n’est pas à la bonne longueur est un parasite. Pour résoudre le problème : on revoit soit les amorces, soit le Tm en jouant sur la température d’hybridation pour jouer sur la spécificité d’hybridation.

Formation de dimères d’amorces : si on met un excès d’amorce, on force l’auto- ou l’inter hybridation des amorces. Un fragment apparaissant à moins de 100pb est un dimère d’amorce. On doit faire les contrôles nécessaire pour s’assurer d’avoir un fragment spécifique. 4) PCR limitée quant à la taille de la séquence pouvant être amplifiée :  Sans problème jusqu’à 2 000 pb  De 2 000 à 5 000 pb : essai pour trouver les conditions appropriées  Difficile au dessus ! On doit optimiser les conditions de PCR pour avoir un fragment entier.

V.

Ap Applicatio plicatio plications ns

On a de la PCR préparative. Elle est utilisée en amont du clonage, de façon à préparer les fragments. L’ADN est amplifié pour les expériences ultérieures. On peut partir d’ADN génomique pour amplifier un fragment d’intérêt de 1000pb. On va produire une grande quantité d’ADN que l’on utilisera directement pour du clonage. On va créer des mutations. Ex : 1 pgADN cible au départ ► 1 µg après 30 cycles - Clonage moléculaire (utilisation enzymes de restriction) - Mutagenèse dirigée - Analyse par électrophorèse puis hybridation (Southern Blotting) - Analyse par séquençage…… La PCR analytiques consiste au diagnostic de l’analyse de séquences. - RT-PCR (amplification d’ADNc à partir d’ARNm) - PCR et RT-PCR en temps réel - PCR allèle spécifique - PCR HRM Quant on fait de la PCR, l’enzyme peut rajouter des A au bout du fragment, et ce sans avoir de matrice. L’insert est délimité par des amorces synthétisées avec une séquence particulière. Si les 2 amorces sont séparées par 1000pb, l’insert est de 1000pb. On va mettre des T débordants pour les allier aux extrémités A débordants. Le vecteur a donc des T qui débordent et l’insert aura des A qui débordent. On a des sites de restrictions de chaque côté, on pourra couper avec des enzymes pour extraire le fragment PCR. Clonage du fragment PCR dans un vecteur TA-cloning puis digestion des enzymes de restriction pour recloner dans 2ème vecteur cible. La Taq polymérase rajoute un A à la fin de l’amplification.



Clonage de fragment PCR par ajout de sites de restriction dans amorces :

Au bout des amorces, on rajoute les sites de restriction spécifiques d’une enzyme. L’amorce s’hybride avec la séquence d’intérêt, et on rajoute le site de restriction au bout. La moitié de l’amorce va s’hybrider, et le reste ne s’hybride pas. On se retrouve avec les sites de restriction double brin inclus à partir des amorces. On peut maintenant cloner directement dans le vecteur.



Mutagenèse dirigée : insertion d’une mutation ciblée dans un fragment d’ADN. - 3 PCR effectuées : la mutation se trouve généralement à l’intérieur du fragment. On créé d’abord l’amplification de la moitié du gène, celle de l’autre moitié, puis une 3ème PCR pour rallier les 2. - Les 2 premières permettent l’insertion de la mutation grâce aux amorces - La 3ème amplifie tout le fragment

On veut transformer un T en C. On va par exemple ainsi passer d’une alanine à un tryptophane. PCR 1 L’amorce va amener la mutation. On n’est pas capable de changer une base dans l’ADN ! On va introduire un G dans l’amorce. Tout le reste de l’amorce peut s’hybrider. On amène une mutation, le G pourra rajouter un C en complémentaire. A partir du fragment obtenu avec le G, on obtiendra un C en face. On aura le couple CG, mais il manque la moitié du gène. PCR 2 On introduit une mutation C au lieu du A, on aura ainsi le G en complémentaire. PCR 3 Tous les fragments sont mis ensemble. Les 2 fragments vont s’hybrider, et on va amplifier grâce aux amorces extérieures. A la fin, la mutation est introduite, et la séquence est amplifiée en grande quantité avec la mutation du T remplacé par un G et le A remplacé par un C.

Pour gagner en rapidité, on a développé plusieurs kits : kit de mutagenèse dirigée. On prend un plasmide, 2 amorces portant la mutation ponctuelles complémentaires. On réalise l’amplification en amplifiant tout le plasmide : on n’amplifie pas qu’un fragment interne mais tout le plasmide avec la mutation introduite par les amorces. On se retrouve avec un plasmide de même taille et de même séquence, SAUF qu’elle contient la mutation ponctuelle. On aura un mélange avec le plasmide initial et le plasmide créé. Les plasmides amplifiés sont généralement méthylés. L’enzyme Dpn I ne peut couper sur son site de restriction que quand celui-ci est méthylé. Si l’ADN provient de la bactérie, il comporte des groupements méthyles et Dpn I peut couper. La PCR n’a pas la fonction de rajouter des groupements méthyles. L’ADN parental est méthylé. En revanche, celui créé par PCR n’est pas méthylé. Dpn I ne coupe pas les sites non méthylés. 1) PCR pour amplifier 2 brins plasmide  Mutations apportées dans amorces ! 2) Digestion plasmide initial par DpnI car méthylé ! 3) Transformation plasmide muté !

VI.

PCR en tem temps ps ré réel el

La PCR classique non quantitative ne peut être utilisée pour comparer des quantités d’ADN initiale. On fait 30 cycles de PCR, mais la PCR n’est quantitative qu’en phase exponentielle. A 30 cycles, on est généralement en plateau, cad au maximum de la réaction.

La PCR classique est non quantitative si elle n’est pas arrêtée au cours de la phase exponentielle.  Lecture sur gel du résultat final = arrivée au plateau ! La vitesse d’obtention d’un même nombre de molécule dépend de la quantité initiale.

La PCR temps réel permet de suivre en direct la quantité d’ADN produit. Sur l’écran, on voit la courbe qui se forme à chaque tour/cycle. C’est le même principe que la PCR mais avec une visualisation des résultats ( = amplification A) en temps réel grâce à des molécules fluorescentes. On peut qualifier à chaque tour si l’on a doublé la quantité d’ADN ou non.

Le nombre de cycle va être directement proportionnel à la quantité initiale et au nombre de molécules d’ADN. Les résultats seront proportionnels au nombre de molécules d’ADN initiales. Si la quantité d’ADN initiale est plus importante, le nombre de cycles d’amplification pour arriver à la même quantité finale diminue ! Plus le nombre de cycle augmente et plus on augmente la quantité d’ADN. On arrivera au plateau plus rapidement avec une grande quantité initiale d’ADN. 18 cycles nécessaires puisqu’on est parti d’une plus grande quantité d’ADN au départ. 33 cycles car on part d’une quantité d’ADN plus petite. On utilise un marqueur fluorescent « lu » en temps réel. Ces marqueurs fluorescent le sont seulement lorsqu’ils sont intégrés dans l’ADN, donc plus on aura d’ADN et plus la fluorescence sera marquée. Le marqueur s’intègre dans le petit sillon. Une fois intégré, il reste dans l’ADN. SYBR green : Marqueur s’associant au petit sillon ADN en formation. - Accumulation de la fluorescence lors de l’élongation (ou ré-hybridation) - Perte de la fluorescence lors de la dénaturation

Limite du SYBR green : On ne sait pas ce que l’on amplifie : on ne connait pas la taille du fragment, on ne sait pas s’il y a des dimères d’amorces etc… En effet, toute amplification parasite, dimère d’amorce etc provoque de la fluorescence. On ne peut pas vérifier car on n’a pas de gel. Il n’y a pas de spécificité envers un amplicon (= fragment PCR) particulier. Le signal fluorescent mesuré correspond t-il à notre gène d’intérêt ?

Il est nécessaire de vérifier la courbe de fusion (= melting curve) ! 

Courbe de fusion

On va augmenter progressivement la température en fin d’expérience de PCR ! On l’augmente de 40 à 90°C par paliers de 0,1°C de manière à dénaturer progressivement l’ADN. La fluorescence va alors diminuer. En effet, la fluorescence ne tient que sur des ADN double brin.  Perte de la fluorescence du Sybergreen quand on a dissociation de l’amplicon db. La fluorescence est liée à l’ADN double-brin. La courbe noire est la bonne amplification. Les 2 autres sont des amplifications parasites.

► T°C du pic = Tm de l’amplicon ► Si T°C plus élevée  Amplicon plus grand ou plus riche en GC



Taqman

On couple des amorces PCR avec une sonde qui s’hybride sur les amorces PCR. On utilise une sonde fluorescence spécifique qui s’hybride spécifiquement sur la séquence à amplifier. La sonde porte la fluorescence (fluorophore) ainsi qu’un inhibiteur de fluorescence. Si on a une élongation d’ADN, on aura une dégradation de la sonde (exonucléase 3’-5’ de la Taq Pol), ce qui va engendrer une libération/un relarguage de la molécule fluorescente.  Cette méthode est plus spécifique car on utilise un couple d’amorces ainsi qu’une sonde spécifique.

Les courbes représentent la fluorescence. Elles sont proportionnelles à la quantité d’ADN. Dans le Taqman, la fluorescence vient de la dégradation de la sonde ! Il n’y a pas de proportionnalité par rapport à la synthèse.

Si les amorces s’hybride ailleurs du à une spécificité insuffisante, la polymérase va polymériser, le SYBR s’intègre dans le db et la fluorescence augmente mais ce n’est pas celle du fragment voulu ! La courbe va augmenter et le calcul de la quantité initiale sera faux, on aura des amplifications parasites. Contrairement au SYBR, le taqman contient un élément supplémentaire, la sonde. Elle est spécifique de la séquence à amplifier, elle se positionne entre les 2 amorces. La sonde s’hybridera à un simple brin. Il y aura fluorescence lorsque la sonde sera dégradée. La taq pol va rencontrer la sonde et la dégrader en même temps qu’elle va polymériser 5’-3’. Détermination de la quantité d’ADN cible dans un échantillon initial 1) Il est nécessaire de déterminer l’efficacité (=spécificité) des amorces : - Si efficacité = 100%  1 cycle = doublement de la quantité d’ADN (donc de fluorescence) - Après calcul, si l’efficacité du couple d’amorces = 2  L’ADN est doublé à chaque cycle ! On part du principe que les amorces doivent permettre un doublement de la quantité à chaque tour. 2) Le design des amorces a son importance : on doit éviter les dimères et les amplicons non spécifiques. Une efficacité qui baisse (même faiblement) aura un fort taux d’erreur. On ne peut pas partir du principe que l’efficacité est de 100%.

On va également chercher à déterminer le Ct (Cycle threshold). La valeur Ct correspond au nombre de cycles correspondant à l’augmentation significative de la production d’ADN déterminée par coupure avec la ligne Threshold (= bruit de fond).  Fluorescence (= quantité d’ADN amplifié) a dépassé le bruit de fond ! Sur chaque réaction PCR, on amplifie des échantillons de différentes façons. Les courbes ne sont pas identiques. Le Ct correspond au moment où la courbe qui débute va dépasser la ligne de bruit de fond.

Nombre de fluorescence = f(Ct) La méthode de calcul est appelée méthode des ΔΔCt (voir TD) Le principe de la PCR temps réel est de déterminer des quantités d’ADN cible dans des échantillons complexes et de comparer ces quantités. On veut calculer un nombre de molécule à une molécule près.  Diagnostic microbiologique But : Détecter la présence d’un agent infectieux chez un patient. Ex : diagnostic de la Pneumocytose - Elle est provoquée par un champignon Ascomycète - Pneumopathie létale chez les patients immunodéprimés (patients VIH* ou traités avec thérapies immunosuppressives) Ex : transplantation d’organes, maladies inflammatoires chroniques. Techniques classiques 1) Colorations + microscopie : attention aux nombreux faux négatifs (on affirme qu’il n’est pas infecté alors que si) ou positifs dus par exemple à une ressemblance avec des levures. 2) Immunomarquage (Ac spécifique) + microscopie à fluorescence : c’est le meilleur seuil de détection, cependant il est encore insuffisant !

3) qPCR (PCR quantitative = PCR temps réel) : nouvelle technique permettant de mettre en évidence une corrélation directe entre la quantité d’ADN détectée et l’infection. Si sous le seuil : pas de propagation importante du pathogène. On aura vraiment des valeurs quantitatives.



Diagnostic bioterrorisme -

Jusqu’à 12 PCR en temps réel en 30min ; Approuvé par Homeland Security Détection de pathogènes  Anthrax, Ricine, Variole, Botulisme, Peste… Les réactifs sont congelés  Ajouter eau + échantillon Avantages : portable, simple, solide, reproductibilité et sensibilité importantes.

 Diagnostic agroalimentaire But : 1) Détection précoce de la contamination (bactéries…) au cours du processus de transformation alimentaire 2) Sécurité alimentaire/environnementale : traçabilité des aliments (origine de l’espèce utilisée pour les aliments) ; traçabilité OGM Exemples : Détection des OGM dans les aliments transformés - Directive européenne sur étiquetage des produits contenant les OGM - Il est nécessaire de déterminer la traçabilité : identifier (présence/absence) et quantifier - Cibler les séquences insérées = Promoteur + Transgène + Terminateur Généralement on cible plutôt le promoteur ou le transgène. Protocole : tests PCR en temps réel sur les aliments transformés dès 1999. En général, on utilise des amorces ciblant : - Séquences régulatrices - Séquence transgène En cas de recherche d’une variété particulière (ex : Bt-76) : on utilise une des amorces transgène/hôte (une sur le transgène et une sur l’hôte).

 Diagnostic génétique Détection d’allèles mutées directement chez les patients : PCR allèle spécifique en temps réel But : Quantifier la proportion d’allèles mutées par rapport aux allèles non mutées dans une population cellulaires totale (= proportion de cellules cancéreuses vs normales). Ex : Polyglobulie de Vaquez = prolifération anarchique de cellules souches de moelle osseuse  Surproduction de globules rouges  Augmentation de la viscosité, du travail du cœur et de la congestion de la rate ; diminution de la circulation Base moléculaire : Corrélée à 1 mutation dans gène JAK2 codant protéine tyrosine kinase  Mutation ponctuelle sur protéine : V617F (codon GUU en UUU). Une fois que la mutation est détectée, on pourra designer des amorces capable de détecter des mutations ponctuelles à cette position. Traitement : Hydréa (= Hydroxyurée) : analogue des bases puriques, défaut de réplication + Pégasys (= IFNγ + PEG) : induction de la mort cellulaire Suivi du traitement : PCR allèle spécifique en temps réel - 1 PCR temps réel avec 1 amorce spécifique de l’allèle normale - 1 PCR temps réel avec 1 amorce spécifique de l’allèle mutée. On va alors quantifier chaque allèle et calculer le % d’allèles mutées/non mutées dans la population. Protocole 1) Design d’amorces spécifiques On utilise une amorce positionnée sur l’ADN. On purifie l’ADN génomique normal. On place chaque amorce sur l’allèle normale et sur l’allèle mutée. On pourra ainsi calculer le pourcentage d’allèles mutées et le pourcentage d’allèles normales.

2) PCR en temps réel : sur un même ADN génomique extrait des cellules souches. -

Calcul du nombre d’allèle mutée et normale dans la population Calcul du % mutée/normale : diagnostic de rémission si ≤ 10%.

NB : Pas de correction des allèles mais élimination des cellules avec les allèles mutées !

Deuxième possibilité : PCR HRM (High Resolution Melting) But : Détection de mutations génétiques dans l’ADN db Principe : Basée sur la détermination température de fusion de l’ADN db.

de la

Etapes : 1) PCR en temps réel pour amplifier la région mutée ou normale 2) Chauffage pour dénaturer l’amplicon 3) Détermination de la courbe de fusion en temps réel

Réactifs : Utilisation de fluorophores actifs quand liés à ADN db (ex : SYBRgreen) Si fusion : - db devient sb - baisse de la fluorescence

Détection mutation : Toute mutation modifie température de fusion !

VII.

Séq Séquenç uenç uençag ag age e

But : Détermination de la séquence des bases d’un brin d’ADN Technique : Bas...