Historia kultur in vitro. Podstawowe informacje o kulturach tkankowych. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 1. Historia kultur in vitro. Podstawowe informacje o kulturach tkankowych. 1. Istota hodowli in vitro. Kultury in vitro w szkle) hodowle lub ich tkanek, na sztucznych w warunkach sterylnych, czyli lub do wzrostu i rozwoju o o i o odpowiednie o w postaci (jako gotowy produkt do...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 1. Historia kultur in vitro. Podstawowe informacje o kulturach tkankowych. 1. Istota hodowli organizmów roślinnych in vitro. Kultury in vitro (łac. w szkle) – hodowle roślin lub ich fragmentów (organów, tkanek, komórek) na sztucznych podłożach w warunkach sterylnych, które zapewniają: • pożywkę, czyli podłoże stałe lub płynne do wzrostu i rozwoju roślin zawierające: o wodę; o makro- i mikroelementy; o odpowiednie pH; o źródło węgla w postaci cukrów (jako gotowy produkt fotosyntezy); • światło niezbędne do przeprowadzenia procesu fotosyntezy, ale także dla wielu innych funkcji (rola sygnałowa światła, które odbierane jest przez fotoreceptory) o odpowiednim: o składzie spektralnym; o natężeniu; o trybie (fotoperiodzie); • wymianę gazową oraz CO2 jako dodatkową suplementację potrzebną w fazie ciemnej fotosyntezy np. w hodowlach glonów (obecnie rzadko stosowane przez wysokie koszty i skomplikowane procedury); • odpowiednią temperaturę; • odpowiednią wilgotność; • regulatory wzrostu, które często, ale nie zawsze dodaje się do pożywki np.: o naturalne hormony roślinne; o syntetyczne hormony (sztuczne substancje działające podobnie jak naturalne hormony); o inhibitory. Problemem wielu kultur in vitro jest niskie natężenie światła, które skutkuje niskim natężeniem fotosyntezy (dlatego produkty fotosyntezy znajdują się w pożywce, aby suplementować roślinę), ale także ograniczona wymiana gazowa, wysoka wilgotność i zakażenia. Wszystkie te trudności muszą być na bieżąco rozwiązywane, w celu uzyskania zdrowej i witalnej kultury roślinnej. 2. Podstawowa terminologia. Eksplantat – fragment rośliny wykorzystywany jako materiał wyjściowy do założenia kultury in vitro. Musi zawierać żywe komórki z nieuszkodzonym materiałem genetycznym, które zdolne są do odróżnicowania i nowych podziałów. Wiele z komórek roślin posiada te zdolności, nazywane ogólnie totipotencją, która w konsekwencji prowadzi do możliwości odtworzenia całej rośliny z dowolnego jej fragmentu. Dlatego też większość tkanek roślin nadaje się do tworzenia hodowli in vitro. Wyróżnia się dwa rodzaje eksplantatów, w zależności od ich pochodzenia: • eksplantat pierwotny – z rośliny niesterylnej, która musi zostać wysterylizowana; • eksplantat wtórny – z rośliny już obecnej w hodowli in vitro, a jego pozyskiwanie trzeba przeprowadzać w warunkach sterylnych. Najczęściej wykorzystywanymi częściami roślin do zakładania kultur in vitro są: • merystem wierzchołkowy pędu; • fragment blaszki liściowej z unerwieniem; • merystem boczny pędu; • wycinek łodygi nie zdrewniałej (koniecznie z łykiem);

•

merystem wierzchołkowy korzenia lub sam fragment korzenia.

Pasaż – przeszczepienie fragmentu istniejącej kultury na nową pożywkę. Kalus (tkanka przyranna) – niezróżnicowana tkanka roślinna złożona z komórek miękiszowych i merystematycznych, której powstawanie indukowane jest przez zranienie. Wyróżnia się dwa rodzaje kalusa: • zielony – zdolny do przeprowadzania fotosyntezy; • biały lub żółty – niefotosyntetyzujący, hodowany na pożywkach bogatych w cukry.

Rysunek 1. i 2. Okazy kalusa zielonego i białego.

Wyróżnia się kilka rodzajów procesów rozwojowych mogących zachodzić w kulturach in vitro: • bezpośrednia organogeneza – tworzenie nowych organów z eksplantatu; • bezpośrednia somatyczna embriogeneza – pojawienie się struktur przypominających zarodek, który następnie rozwija się w cały organizm; • pośrednia organogeneza – tworzenie organów na kalusie; • pośrednia somatyczna embriogeneza – tworzenie zarodków na kalusie Ze wszystkimi powyższymi zjawiskami związana jest totipotencja, czyli zdolność komórki do odtworzenia każdego typu komórki, a w konsekwencji całego organizmu. W przeciwieństwie do komórek zwierząt, prawie wszystkie komórki roślinne posiadają taką zdolność (prócz silnie wyspecjalizowanych czy np. zdrewniałych).

Rysunek 3. Procesy rozwojowe w roślinnych kulturach in vitro.

Mikrorozmnażanie (mikropropagacja, rozmnażanie klonalne) – wykorzystanie kultur in vitro do masowego rozmnażania wegetatywnego roślin pozwalające uzyskać nawet kilka tysięcy roślin potomnych z jednego eksplantatu w ciągu roku. Wyróżnia się cztery etapy mikrorozmnażania: • założenie kultury aksenicznej (sterylnej), indukcja rozwoju pąków bocznych lub pąków przybyszowych;

• • •

namnażanie; przygotowanie do wzrostu w warunkach ex vitro: o elongacja pędów; o ukorzenienie (zazwyczaj przy użyciu odpowiednich regulatorów wzrostu); adaptacja do warunków ex vitro.

3. Historia kultur in vitro. Początki kultur in vitro: • podstawy teoretyczne: o XVIII wiek: § Robert Hooke na podstawie struktury mikroskopowej korka wprowadza pojęcie „komórki”; § Marcello Malphigi wprowadza pojęcie „tkanki”; o fizjolog człowieka Theodore Schwann i botanik Matthias J. Schleiden (1838/1839) niezależnie przedstawiają komórkową teorię budowy organizmów, według której wszystkie komórki mają potencjał do wytworzenia całkowicie funkcjonalnego organizmu, co stanowi podwaliny nowej dziedziny nauk przyrodniczych – biologii komórki: § wszystkie organizmy są zbudowane z komórek; § komórka jest jednostką strukturalną życia (jednostki mniejsze niż komórki nie są żywe); § komórki powstają przez podział istniejących wcześniej komórek (spontaniczna generacja nie istnieje); § komórki mogą być hodowane w celu wytworzenia większej ich ilości; o patolog Ludwig Karl Virchow (1858) formułuje tezę „Omnis cellula a cellula”, co oznacza, że chore komórki zawsze pochodzą od zdrowych komórek; • podstawy praktyczne: o na XIX wiek przypada rozwój botaniki, cytologii oraz mikrobiologii: § Louis Pasteur obalił teorię samorództwa, opracował sterylizację pożywek i metody uzyskiwania czystych kultur bakterii; § Rober Koch jako pierwszy wykorzystał agar do zestalania pożywek; § Charles Darwin opracował hipotezę o istnieniu hormonów roślinnych (badania fototropizmu przedstawione w publikacji “The Power of Movement in Plants” 1881); § Johan Knop stworzył sztuczną pożywkę mineralną dla roślin, opracowaną na podstawie składu gleby. Gottlieb Haberlandt – austriacki botanik uważany za twórcę kultur in vitro od momentu opublikowania „Culturversuche mit isolieren Pflanzellen” (1902), gdzie przedstawił: • hodowle komórek izolowanych z miękiszu palisadowego, skórki i hodowle włosków epidermalnych kilku roślin (jasnoty purpurowej (Lamium purpureum) i hiacynta wodnego (Eichornia crassipes), śniedka (Ornithogalum), miodunki (Pullmonaria mollissima), pokrzywy (Urtica) i trzykrotki (Tradescantia)); • przepis na pożywkę Knopa, w której innowacyjnymi składnikami były sacharoza, asparagina oraz pepton; • obserwacje żywych komórek prowadzonych przez kilkadziesiąt dni, w których zanotował wzrost objętości, ale brak podziałów: o przyczyną jego niepowodzeń był wybór zróżnicowanych i wyspecjalizowanych komórek oraz gatunków jednoliściennych, a także brak sterylności w prowadzeniu hodowli.

Dalsze eksperymenty Haberlandta obejmowały hodowlę cienkich skrawków ziemniaka, na których obserwował podziały komórek, jeżeli dane skrawki zawierały wiązkę przewodzącą (leptohormone). Na tej podstawie sformułował prorocze hipotezy: • izolowane komórki roślinne można będzie kiedyś utrzymywać w czystych hodowlach przez dowolnie długi czas; • nawet komórki somatyczne (niegeneratywne) można będzie pobudzić do tworzenia zarodków i odtwarzania całych roślin; • substancje pobudzające podziały zostaną otrzymane z tkanek merystematycznych i rozrodczych; • hodowle komórkowe staną się ważnym narzędziem w badaniach rozwoju roślin. Na lata 20. i 30. XX wieku przypada okres bezskutecznych prób kontunuowania prac badawczych Haberlandta przez szereg naukowców, jednak w międzyczasie następuje rozwój metod hodowli komórek zwierzęcych, a także odkrycia dotyczące kultur roślinnych niezależne już od prac Austriaka: • Simon (1908) doprowadził do rozwoju kalusa, korzeni i pąków na fragmentach pędów topoli (hodowle były jednak niesterylne); • Kotte i Robbins (1922) niezależnie otrzymują kultury wierzchołków korzeni grochu i kukurydzy, a także postulują znaczenie komórek merystematycznych; o hodowle wierzchołków pędów prowadzone przez Robbinsa w 1922 roku i White’a w 1933 roku wykazywały bardzo słaby wzrost: dopiero w 1946 roku Ball opisał regenerację całej rośliny z merystemów wierzchołkowych; • Blumenthal i Meyer (1924) oraz Rehwald (1927) jako pierwsi zaobserwowali tworzenie kalusa m.in. na plastrach marchwi, jednak zaniechali oni dalsze badania ze względu na błędną interpretację wyników zakładającą, że na hodowli pojawiły się tumory. Krokiem milowym hodowli kultur in vitro okazało się odkrycie auksyny: • Darwin (1881) opisał fototropizm na podstawie obserwacji, że zakrycie wierzchołka koleoptylu niweluje efekt światła; • Boysen-Jensen (1910) dowiódł, że usunięcie wierzchołka powoduje utratę fototropizmu; • Went (1926) wyizolował, a Kogl (1934) zidentyfikował pierwszą auksynę – kwas indolilo-3-octowy (nominacja do Nagrody Nobla).

Rysunek 4. Schemat eksperymentów Darwina i Boysen-Jensena udowadniające istnienie fototropizmu u organizmów roślinnych.

Rysunek 5. Schemat eksperymentu Wenta wskazującego na obecność auksyn w tkankach roślinnych.

Dzięki odkryciu naturalnych hormonów roślinnych udało się z sukcesem stworzyć pierwsze kultury in vitro: • White, Nobecourt i Gautheret (1939) niezależnie wykazują, że tkanki roślinne można namnażać in vitro przez dowolnie długi czas dzięki działaniu auksyny. Dwie z tych prac dotyczyły marchewki, trzecia kalusa tytoniu. Kolejnym ważnym przełomem w tworzeniu i prowadzeniu kultur tkanek roślinnych było odkrycie cytokinin: • Van Overbeek et al. (1941) użyli mleka kokosowego (bielma) do utrzymania hodowli zarodków mieszańcowych bielunia (Datura); o mleko kokosowe znalazło również zastosowanie w hodowlach in vitro: § marchewki Caplina i Stewarda (1948), powodując lepszą stymulację proliferacji komórek niż przy użyciu auksyn; § roślin jednoliściennych i paproci Morela (1950); • Miller et al. (1955) wyizolowali ze spermy śledzia pierwsze kinetyny, czyli produkty rozpadu DNA będących pochodną adeniny (A); • Skoog i Miller (1957) opisywali hormonalną regulację morfogenezy z wykorzystaniem hormonów roślinnych, co doprowadziło do: o odkrycia pierwszej naturalnej cytokininy – zeatyny (wyizolowanej z kukurydzy). Odkrywanie coraz to nowszych substancji chemicznych wpływających na wzrost i rozwój roślin przyczyniło się do wytworzenia skutecznych przepisów na pożywki hodowlane: • pożywka White’a (1943) opracowana na podstawie pożywki Uspenskich do hodowli glonów z dodatkiem mikroelementów i witamin (glicyna, kwas nikotynowy, tiamina, pirydoksyna); • pożywka Murashige i Skooga [MS] (1962), która aktualnie jest najczęściej stosowana: o przygotowana do hodowli komórek miękiszu tytoniu Wisconsin 38 (biotesty do badania aktywności regulatorów wzrostu roślin); o opracowana na podstawie pożywki White’a, gdzie zawartość składników odżywczych miała zapewnić maksymalne tempo wzrostu, a skład pożywki MS odpowiadał składowi ekstraktu z liści tytoniu; o mikroelementy oraz mio-inozytol dodane zostały “na wszelki wypadek” (żelazo w formie chelatu); • pożywka Gamborga [B5] (1968): o początkowo stosowana do hodowli zawiesinowych komórek soi; o jest “efektem ubocznym” badań nad metabolizmem wtórnym i opracowana została na podstawie pożywki PRL-4C zapewniającej dobry wzrost różnych

typów komórek (z korzeni, hypokotyli, łodyg, ogonków liściowych) wielu gatunków roślin; o witaminy: wyraźny efekt zawartości tiaminy, pozostałe dodawane “na wszelki wypadek”. Z tak opracowanymi metodami następuje dalszy, gwałtowny rozwój technik in vitro: • Reiner i Stewart (1958) – somatyczna embriogeneza marchwi (kalus i hodowla zawiesinowa); • Muir et al. (1958) – kultury pojedynczych komórek (z wykorzystaniem warstwy odżywczej tzw. “nurse cells”); • Jones et al. (1960) – hodowla pojedynczych komórek w mikrokomorach z użyciem kondycjonowanej pożywki; • Vasil i Hildebrandt (1965) – regeneracja rośliny tytoniu z pojedynczej komórki (dowód na totipotencję komórek roślinnych); • Guha i Maheshwari (1964) – kultury pylników Datura inoxia, otrzymanie haploidalnych zarodków; • Bourgin i Nitsch (1967) – regeneracja roślin tytoniu z ziaren pyłku; • Cocking (1960) – enzymatyczna izolacja protoplastów; • Kao et al. (1970) – obserwacja tworzenia ściany komórkowej przez protoplasty i podziałów zregenerowanych komórek; • Takebe et al. (1971) – regeneracja roślin z protoplastów; • Carlson et al. (1973) – fuzja protoplastów Nicotiana glauca i Nicotiana langsdorfii (hybrydyzacja somatyczna); • Melchers et al. (1978) – mieszańce somatyczne pomidora i ziemniaka; • Zentkeler et al. (1975) – zapylenie in vitro, mieszańce międzygatunkowe i międzyrodzajowe. 4. Transformacja genetyczna. Rośliny genetycznie modyfikowane. Pierwsze doniesienie o istnieniu procesu naturalnej transformacji genetycznej przedstawił Griffith w 1928 roku opisując nabycie wirulencji przez szczep R od szczepu S bakterii z gatunku dwoinki zapalenia płuc (Streptococcus pneumoniae). Nieznana wówczas była natura „czynnika transformującego”. W 1944 roku Avery zidentyfikował DNA jako nośnik informacji genetycznej, a także przeprowadził badania nad glebową bakterią Agrobacterium tumefaciens, powodującą guzowatość u roślin, co dalej doprowadziło do: • odkrycia przez Zaenena et al. (1974) plazmidu Ti (od ang. tumor inducing) oraz procesu integracji T-DNA do genomu rośliny przez zespół Chiltona (1977).

Rysunek 6. Przenoszenie fragmentu T-DNA z Agrobacterium do genomu jądrowego rośliny.

Rośliny transgeniczne – rośliny, których DNA zostało zmodyfikowane metodami inżynierii genetycznej w celu uzyskania pożądanego efektu fenotypowego. Pierwsza z metod transformacji dzikich osobników była oparta właśnie na wektorach pochodzących od Agrobacterium tumefaciens, następnie opracowano: • bezpośrednią transformację protoplastów przez szok osmotyczny lub elektryczny; • bezpośrednią transformację komórek lub tkanek z wykorzystaniem działa genowego. Genetycznie modyfikowane rośliny mają zastosowanie w kulturach in vitro przy: izolacji protoplastów, regeneracji oraz selekcji transformowanych roślin z wykorzystaniem genów selekcyjnych bądź markerowych. 5. Znaczenie roślinnych kultur in vitro. Od momentu odkrycia w XX wieku aż do czasów obecnych roślinne kultury in vitro ogromnie zyskiwały na znaczeniu, znajdując aktualnie zastosowanie w: • mikrorozmnażaniu; • hodowli roślin: o otrzymywanie haploidów (androgeneza, gynogeneza); o mieszańców międzygatunkowych (kultury zarodków, embryo rescue); • produkcji sztucznych nasion (zarodków somatycznych); • fuzji protoplastów wymaganej do otrzymania mieszańców somatycznych; • selekcji roślin np. po mutagenezie; • tworzeniu roślin transgenicznych (selekcji, regeneracja); • uwalnianiu roślin od patogenów; • produkcji metabolitów wtórnych; • tworzeniu banków genów; • krioprezerwacji; • rozmnażaniu gatunków zagrożonych; • badaniach naukowych....