Hormony roślinne i regulatory wzrostu w kulturach in vitro. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 7. Hormony i regulatory wzrostu w kulturach in vitro. 1. substancji organicznych wzrost i Regulatory wzrostu (i rozwoju) grupa substancji o budowie chemicznej, nie w metabolizmie podstawowym to wszystkie metabolity jest regulacja takich jak wzrost, czy w odpowiedziach na czynn...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 7. Hormony roślinne i regulatory wzrostu w kulturach in vitro. 1. Podział substancji organicznych regulujących wzrost i rozwój roślin. Regulatory wzrostu (i rozwoju) roślin – grupa niskocząsteczkowych substancji o zróżnicowanej budowie chemicznej, które nie uczestniczą w metabolizmie podstawowym rośliny. Są to wszystkie metabolity wtórne, których podstawową funkcją jest regulacja procesów życiowych takich jak wzrost, podziały czy różnicowanie komórek. Uczestniczą w odpowiedziach na czynniki środowiskowe i są naturalnie transportowane w całej roślinie, a &'( efekt fizjologiczny wywołują, jeśli ich stężenie przekracza 10#$ % . Regulatory wzrostu mogą ( być zarówno naturalne jak i syntetyczne. Dana substancja jest regulatorem rozwoju, gdy: • zmiana stężenia substancji w roślinie wykazuje zależność między intensywnością badanego procesu; • potraktowanie rośliny tą substancją inicjuje lub modyfikuje przebieg danego procesu; • wywołane zmiany stężenia tej substancji w roślinie modyfikują przebieg badanego procesu metabolicznego. Hormony roślinne (fitohormony) – uczestniczące w metabolizmie podstawowym substancje &'( aktywnie działające na organizm roślinny w wyjątkowo niskich stężeniach ( 10#) % ( ), charakteryzujące się powszechnością ich występowania i funkcji w obrębie królestwa roślin. Dotychczas poznanymi hormonami roślinnymi są związki z grup: • znanych od dawna: o auksyny; o cytokininy; o gibereliny; o seskwiterpeny (kwas abscysynowy); o alkeny (etylen); • poznanych niedawno: o brasinosteroidy; o jasmoniany (kwas jasmonowy); o hydroksykwasy karboksylowe (kwas salicylowy); o strigolaktony. Zarówno regulatory wzrostu jak i fitohormony można wykorzystywać jako suplementy do pożywek w kulturach in vitro w celu uzyskania pożądanych efektów morfologicznofizjologicznych eksplantatu. Należy jednak pamiętać, że działanie egzogennych regulatorów w kulturach zależy od stanu fizjologicznego preparatu oraz endogennych stężeń hormonów!

Rysunek 1. Wpływ auksyn i cytokinin na organogenezę in vitro.

2. Hormony roślinne: auksyny. Pierwszym odkrytym hormonem roślinnym był kwas indolilo-3-octowy (IAA), który obecnie zaliczany jest do grupy auksyn. W naturalnych warunkach hormony te warunkują wzrost wydłużeniowy komórek, dominację wierzchołkową, organizację merystemów, polarność komórek i tkanek. Mają udział w ruchach roślin (tropizmach), a także w organogenezie oraz różnicowaniu tkankowym (ang. patterning). W kulturach in vitro naturalne i syntetyczne auksyny wykorzystuje się do: • tworzenia korzeni przybyszowych (wysokie stężenie); • tworzenia pędów przybyszowych (niskie stężenie); • indukcji embriogenezy somatycznej; • indukcji i wzrostu kalusa; • hamowania rozwoju pąków bocznych; • hamowania elongacji korzeni. Aktywność auksynowa zapewniana jest przez obecność w cząsteczkach tych hormonów pierścienia aromatycznego i grupy karboksylowej w odległości 5,5 Å od siebie. NATURALNE

SYNTETYCZNE

kwas indolilo-3-octowy (IAA)

kwas naftalenooctowy (NAA)

kwas fenylooctowy (PAA)

kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolinowy (picloram)

kwas 4-chloro-indolilo-3-octowy (4-Cl-IAA)

kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy (dicamba)

Tabela 1. Podział hormonów auksynowych ze względu na pochodzenie.

Aktywność auksynową in vitro wykazują również prekursory auksyn np. kwas indolilo-3masłowy (IBA), natomiast auksyny syntetyczne charakteryzują się wyższą aktywnością i stabilnością, a także różnicami w transporcie np. NAA wnika do komórek na drodze dyfuzji. Dzięki temu auksyny sztuczne w wysokich stężeniach często wykorzystywane są jako herbicydy w rolnictwie. Naturalne auksyny charakteryzują się trzema poziomami regulacji: • biosynteza i metabolizm: o 5 szlaków biosyntezy, przy czym większość jest zależna od obecności tryptofanu; o formy nieaktywne występują w postaci koniugatów estrowych i amidowych; • polarny transport: o białka AUX/LAX odpowiadają za transport do komórki; o białka PIN i ABCD odpowiadają za wypływ z komórki; § gradienty auksynowe wywołane transportem tych hormonów wewnątrz komórek odpowiadają za regulację morfogenezy i rozwoju; o istnieją także inhibitory transportu i działania auksyn: § białka 1-NOA, 2-NOA i CHPAA są inhibitorami dokomórkowego transportu auksyn jednak w pewnych warunkach wykazują słabą aktywność auksynową;

białka NPA i TIBA są inhibitorami wypływu auksyn z komórki; białko PCIB nazywane jest antyauksyną ponieważ przekazuje sygnał od auksyn do genów indukowanych przez nie, doprowadzając do inhibicji ekspresji; • część z inhibitorów działania auksyn wpływa też na inne procesy komórkowe jak zaburzenia dynamiki błon czy podziałów komórkowych; transdukcja sygnały hormonalnego: o szlak SCFTIR1/AFB-Aux/IAA – wpływający bezpośrednio na auksynowy czynnik transkrypcyjny (ARF); o receptor ABP1. § §

•

Rysunek 2. Szlak odpowiedzi na auksynę.

3. Hormony roślinne: cytokininy. Cytokininy to druga w kolejności odkrycia grupa hormonów roślinnych, wykazująca antagonistyczne działanie do hormonów auksynowych. Pierwszą odkrytą cytokininą była kinetyna. W naturalnych warunkach hormony te regulują podziały komórkowe, starzenie tkanek i transport asymilatów. Regulują także aktywność cytokininową oraz tworzenie brodawek korzeniowych. W kulturach in vitro dodatek cytokinin wykorzystywany jest do: • tworzenia pędów przybyszowych; • hamowania tworzenia korzeni; • proliferacji komórek; • indukcji i wzrostu kalusa; • rozwoju pąków bocznych przez zniesienie dominacji wierzchołkowej; • hamowania wydłużania pędów; • hamowania starzenia się liści.

NATURALNE (POCHODNE ADENINY)

SYNTETYCZNE (POCHODNE ADENINY I MOCZNIKA)

zeatyna

6-benzyloaminopuryna (BAP)

N6-izopentenylo-adenina

kinetyna tidiazuron

glikozydy cytokinin (rybozydy i rybotydy)

N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’fenylomocznik (CPPU)

Tabela 2. Podział hormonów cytokininowych ze względu na pochodzenie.

Regulacja aktywności cytokinin zakłada ich biosyntezę i aktywację przez koniugacje odwracalną (O-glikozylacja) lub nieodwracalną (N-glikozylacja). Dezaktywacja przebiega z udziałem oksydaz cytokininowych. Hormony następnie transportowane są do wszystkich tkanek roślinnych, a ich transporterami są: • ABCG14 – odpowiedzialny za eksport cytokinin z komórek korzenia, które są miejscem syntezy hormonów do ksylemu, co powoduje stymulację wzrostu pędu; • PUP14 – transportujący cytokininy z ksylemu do komórek poprzez supresję transdukcji sygnału przez kinazy AHK. Transdukcja sygnału hormonalnego cytokinin odbywa się dzięki receptorowi - kinazie histydynowej HK znajdującej się w siateczce śródplazmatycznej i błonie komórkowej. Sygnał następnie przekazywany jest na fosfotransferazy histydynowe AHP i trafia na regulatory odpowiedzi RR. Negatywna regulacja przekazu sygnału od cytokinin jest możliwa dzięki obecności pseudo-fosfotransferazom histydynowym (PHP). Jednym z rodzajów cytokinin, które obecnie są badane pod kątem usprawnienia procesu mikropropagacji są meta-topoliny. Są to aromatyczne hormony wyizolowane z topoli, które przyczyniają się do wydajnej stymulacji proliferacji pędów, a także stymulują ukorzenianie, co przyczynia się do lepszej aklimatyzacji ex vitro eksplantatów. Stosowanie meta-topolin zapobiega witryfikacji i nekrozie wierzchołków, a także opóźnia starzenie i zmniejsza zmienność somaklonalną u roślin ozdobnych i chimer. 4. Hormony roślinne: gibereliny. Gibereliny w organizmach roślinnych odpowiadają za odpowiedni wzrost, kiełkowanie, kwitnienie oraz zawiązywanie owoców. W hodowlach in vitro dodanie giberelin powoduje wydłużanie pędów, przerywanie spoczynku nasion, zarodków somatycznych, pąków wierzchołkowych i cebul, a także przyczynia się do hamowania powstawania korzeni przybyszowych. Gibereliny to cała rodzina związków diterpenowych, przy czym tylko część z nich jest aktywna biologicznie i są to: GA4, GA7, GA1 oraz GA3. Inhibitorami giberelin są związki należące do anty-giberelin, nazywanych również retardantami, które powodują zahamowanie syntezy GA, co skutkuje: • skróceniem międzywęźli; • indukcji tworzenia bulw, pseudobulw i cebul; • zahamowanie wzrostu liści, co zapobiega witryfikacji; • ochroną przed stresami abiotycznymi.

Do retardantów wykorzystywanych w rolnictwie należą m.in.: ancymidol, paclobutrazol i CCC (chlorek chloromekwatu). 5. Pozostałe hormony roślinne. Kwas abscysynowy (ABA) – jedyny przedstawiciel grupy hormonów roślinnych seskwiterpenów syntetyzowany w komórkach roślin podczas szlaku kwasu mewalonowego lub oksydacji karotenoidów. W naturalnych warunkach jest niezbędny do prawidłowego dojrzewania i wejścia nasion w spoczynek, syntezy materiałów zapasowych, starzenia, odporności na susze i stres, a także zachodzenia ruchów szparek. W kulturach in vitro przyczynia się do: • tworzenia bulw i cebul; • dojrzewania zarodków somatycznych; • zapobiegania przedwczesnemu kiełkowaniu zarodków np. w przypadku sztucznych nasion; • ułatwienia aklimatyzacji (anty-transpirant); • spowolnienia wzrostu; • przygotowania do krwioprezerwacji. Etylen (C2H4) – gazowy węglowodór nienasycony z grupy alkenów przyczyniający się do dojrzewania owoców, starzenia oraz podziałów i wzrostu wydłużeniowego komórek, wzrostu korzeni i odpowiedzi na stres. Akumulacja etylenu w naczyniach hodowlanych ma często negatywny wpływ na wzrost i rozwój kultur in vitro, ale czasem wykorzystywany jest do: • stymulowania lub hamowania wzrostu i organogenezy. Eten wykazuje zróżnicowany wpływ na kultury kalusa, hodowle zawiesinowe, organogenezę przybyszową i embriogenezę. Inhibitorami syntezy i działania etylenu są substancje: • absorbujące etylen: o nadmanganian potasu; o nadchloran rtęci; • hamujące działanie etylenu: o jony srebra; o NBD; o substancje chelatujące; • hamujące syntezę etylenu: o aminoetoksyglicyna (AVG); o kwas aminoizomasłowy (AIBA); o jony kobaltu; o poliaminy. Jasmoniany (jasmonidy) – fitohormony podobne swoją budową do prostaglandyn, które uczestniczą w odpowiedzi na stresy biotyczne i abiotyczne, a także powodują starzenie liści i dojrzewanie owoców. W kulturach in vitro: • indukują powstawanie bulw i cebul; • powodują tworzenie merystemów; • hamują wzrost kalusa i korzeni. Kwas salicylowy – uczestniczy w odpowiedzi na patogeny (biotrofów), reakcjach obronnych, nabytej odpowiedzi systemicznej, a także indukuje kwitnienie i termogenezę. W kulturach in vitro wykorzystywany do zwiększania trwałości kwiatów, pobudzania powstawania zarodków

somatycznych oraz indukcji tuberyzacji. Innymi regulatorami wzrostu mające zastosowanie w hodowlach eksplantatów są: • poliaminy (spermina, spermidyna) – odpowiedzialne za tworzenie korzeni przybyszowych, pędów oraz zarodków somatycznych; • oligosacharydy – fragmenty ścian komórkowych; • systemina – peptyd powstający w odpowiedzi na zranienie; • substancje produkowane przez mikroorganizmy i grzyby.

Rysunek 3. Interakcje hormonalnych szlaków sygnałowych (ang. crosstalk)....