Światło jako główny czynnik wpływający na fizjologię roślin w kulturach in vitro. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 4. jako czynnik na w kulturach in vitro. 1. Znaczenie w w hodowlach jest kluczowym elementem do przeprowadzania fotosyntezy, a w specyficznych odgrywa receptorami fitochromy, czyli barwniki procesy metaboliczne w odpowiedzi na czerwone. Innymi receptorowymi kryptochromy niebie...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 4. Światło jako główny czynnik wpływający na fizjologię roślin w kulturach in vitro. 1. Znaczenie światła w życiu roślin. Światło w hodowlach roślinnych jest kluczowym elementem do prawidłowego przeprowadzania fotosyntezy, a obecność w komórkach roślin specyficznych fotoreceptorów odgrywa również rolę sygnałową. Głównymi receptorami są fitochromy, czyli barwniki indukujące procesy metaboliczne w odpowiedzi na światło czerwone. Innymi białkami receptorowymi są kryptochromy (światło niebieskie) czy β-tropiny zawierające nukleotydy flawinowe czy związki, które w swojej strukturze posiadają reszty tryptofanowe odpowiedzialne za rejestrację promieniowania z UV-B. Promieniowanie widzialne (380-780 nm), ale także z zakresu ultrafioletu i podczerwieni może być znaczącym czynnikiem stresowym zaburzającym prawidłowy wzrost i rozwój eksplantatów. Do prowadzenia wydajnych kultur in vitro niezbędne jest zapewnienie hodowlom odpowiedniego natężenia, składu spektralnego oraz fotoperiodu światła.

Rysunek 1. Widmo czynnościowe fotosyntezy – zależność natężenia danego procesu od długości fali światła pokrywa się z widmem absorpcji barwników fotosyntetycznych.

W zależności od badanych właściwości do pomiarów światła wykorzystuje się: • fotometrię – pomiar promieniowania widzialnego za pomocą czujnika fotometrycznego o charakterystyce spektralnej zbliżonej do wrażliwości ludzkiego oka. Wykorzystywana do badania zjawisk psychofizycznych człowieka a wyniki są nieprzeliczalne na jednostki radiometryczne i podawane z dużym przybliżeniem [luks, lumen, kandela]; • radiometrię – pomiar strumienia energii promienistej, głównie wykorzystywana do badań i kalibracji światła w fitotronach: $ o strumień (moc) promieniowania: 1W = 1 &; '

%

o natężenie promieniowania: 1 () ; '

$

; o natężenie napromieniowania (ang. fluence rate): 1 & = 1 (+×+%& * $

•

o napromieniowanie (ang. energy fluence): 1 &; % kwantometrię – wykorzystywany w fotobiologii i fotochemii pomiar strumienia kwantów (w tym ich gęstości):

µE

/%01+23456ó3

; = + (+×+%& o 1E (einstein) = 1 mol kwantów (6,023+ × + 10>?). Światło słoneczne jest głównym źródłem energii dla roślin, jednak bardzo często niejednolitym i zmiennym, a na jego właściwości wpływają: • składniki atmosfery powodujące rozpraszanie i zmienianie składu promieniowania, dlatego widmo to dla roślin ma inny kształt niż to, które emituje Słońce; • pogoda, pora roku, szerokość geograficzna czy pora dnia (zmiany te są ważnymi informacjami dla roślin); • lokalne zmiany widma spowodowane np. przez przechodzenie promieniowania przez warstwę roślinności czy zacienienie. o

(+×+%&

Rysunek 2. Zmiany spektrum widma słonecznego na Ziemi.

2. Źródła światła w hodowli in vitro. Inne niż naturalne, czyli sztuczne źródła światła dla organizmów roślinnych można podzielić na generacje reprezentujące stopień zaawansowania i efektywności: • pierwsza generacja: o ogień; • druga generacja (żarówki): o lampy żarowe; o żarówki halogenowe; • trzecia generacja (lampy wyładowcze): o lampy fluorescencyjne o bardzo wąskiej, specyficznej charakterystyce spektralnej; o lampy metalohalogenkowe; o lampy neonowe; o lampy rtęciowe; o lampy sodowe; • czwarta generacja: o diody LED. Piątą generacją mają stać się lampy laserowe, które jednak nadal nie są dopuszczone do powszechnego użycia. Obecnie najczęściej stosowanymi źródłami światła w hodowlach in vitro są lampy fluorescencyjne, a także diody LED. Wszystkie pozostałe urządzenia trzeciej generacji używane są jedynie do doświetlania roślin w szklarniach, natomiast źródła drugiej i

pierwszej generacji wyszły z użytku. Podstawowymi wymaganiami jakie powinny spełniać sztuczne źródła światła są odpowiedni skład spektralny oraz niska emisja ciepła 1 podczas pracy. µE

Światło w hodowlach in vitro powinno charakteryzować się niskim natężeniem (ok. 50 (+×+%&), co umożliwia zaoszczędzenie energii (dzięki temu cięcie kosztów) i ograniczenie emisji ciepła, jednak takie natężenie może skutkować niską wydajnością lub całkowitą inhibicją fotosyntezy. W trakcie prowadzenia badań należy zwrócić uwagę na fakt, że natężenie oraz skład spektralny wewnątrz naczyń hodowlanych jest inny niż ten emitowany przez lampy, dlatego należy to dokładnie określić, ponieważ brak informacji dotyczących parametrów stosowanego oświetlenia skutkuje brakiem powtarzalności wyników pomiędzy laboratoriami. Świetlówka (lampa fluorescencyjna) – lampa wyładowcza, w której światło emitowane jest przez luminofor wzbudzony przez promieniowanie ultrafioletowe powstałe wskutek wyładowania jarzeniowego w rurze wypełnionej gazem. Światło UV wzbudza cząsteczki luminoforu (RGB Fosfor), który emituje falę świetlną w zakresie światła widzialnego o temperaturze barwowej2: światła dziennego (ang. daylight), światła ciepło-białego (ang. warmwhite) lub zimno-białego (ang. cool-white). W praktyce stosuje się kombinację tych świetlówek.

Rysunek 3. Budowa lampy fluorescencyjnej CCFL.

Diody elektroluminescencyjne (LED) – źródła światła oparte na zjawisku kombinacji promienistej w półprzewodnikach. Do oświetlania hodowli in vitro stosuje się panele z diodami LED emitujących światło w różnych kolorach. Zaletami diod LED są: • możliwość wytworzenia światła o różnej długości fali, co pozwala na precyzyjną kontrolę składu spektralnego; • trwałość, czyli długi czas działania, który u świetlówek maleje z czasem; • niska emisja ciepła; • równomierne natężenie światła; • natężenie światła jest wprost proporcjonalne do natężenia prądu; • wysoka wydajność energetyczna; • możliwość precyzyjnej, zindywidualizowanej regulacji światła w fitotronie; • możliwość zwiększenia natężenia światła i poprawy wydajności fotosyntezy. 1

w celu eliminacji nadmiernej energii cieplnej uwalnianej przez lampy można korzystać ze specyficznych filtrów cieplnych (szklanych lub wodnych), które są przydatne w eksperymentach, jednak niepraktyczne na większą skalę. 2 temperatura barwowa – skala opierająca się na barwie promieniowania emitowanego przez ciało doskonale czarne w różnych temperaturach.

Rysunek 4. Zasada działania diody LED.

3. Cechy światła i ich wpływ na rośliny w kulturach in vitro. Natężenie światła – czyli gęstość strumienia świetlnego padającego na daną powierzchnię w hodowlach in vitro jest stosunkowo niskie, co pozwala ograniczyć koszty i emisje ciepła. Jeszcze niższe natężenia wykorzystuje się w bankach tkanek, w których światło odgrywa rolę ograniczającą w procesie fotosyntezy i spowalnia ich przyrost, co umożliwia przechowywanie przez dłuższy czas.

Rysunek 5. Zależność między natężeniem światła a możliwością wiązania CO2.

Światło wpływa nie tylko na proces fotosyntezy, ale także na ekspresję genów czy morfologię, a wymagania co do intensywność oświetlenia zależą od gatunku rośliny, ale także zmieniają się w trakcie prowadzenia hodowli:

wysokie natężenie często stosowane jest do indukcji i proliferacji pędów przybyszowych (np. astry, chryzantemy, gatunki drzewiaste), tworzenie pąków przybyszowych, kiełkowania nasion i zarodków somatycznych, a także jest wykorzystywane do wstępnej aklimatyzacji kultur do warunków ex vitro; • niskie natężenie światła stosuje się na początkowych etapach hodowli oraz do indukcji tworzenia korzeni przybyszowych. W hodowlach in vitro wydajność fotosyntezy zależna jest od wielu czynników (stan aparatu fotosyntetycznego, obecność cukrów itp.), nie tylko od natężenia światła. Ciemność, czyli stan całkowitego braku promieniowania świetlnego również odgrywa ważną rolę w prowadzeniu kultur eksplantatów. Jest ważna na początkowych etapach hodowli, często konieczna do indukcji i proliferacji kalusa, a także stosowana do etiolacji siewek czy elongacji hipokotyla lub epikotyla. U niektórych gatunków roślin wymagana jest do: • tworzenia pędów przybyszowych; • tworzenia bulw; • embriogenezy somatycznej. Krótki okres ciemności (kilka dni) u większości gatunków powoduje stymulację organogenezy i embriogenezy, a także ukorzeniania. Przeniesienie hodowli z ciemności do światła powoduje różnicowanie chloroplastów i syntezę chlorofilu. •

Rysunek 6. Aktywacja fitochromów roślinnych przez różne długości fal światła i reakcja fizjologiczna roślin.

Skład spektralny – opisujący długość fal promieniowania wchodzących w skład wiązki światła. Poszczególne fale promieniowania elektromagnetycznego mogą być odbierane i pochłaniane przez rośliny za pomocą fotoreceptorów, które następnie uruchamiają określoną reakcję fizjologiczną. W przypadku roślin największy wpływ promienie świetlne mają na morfogenezę: • światło niebieskie (jego efekt zależny jest od obecności i stężenia egzogennych hormonów): o stymulacja proliferacji i morfogenezy kalusa; o zahamowanie wzrostu kalusa i podziałów w hodowlach zawiesinowych;

o zahamowanie rozwoju pąków bocznych; światło czerwone (część efektów światła czerwonego jest odwracalna przez daleką czerwień, a samo promieniowanie często można zastąpić cytokininami): o stymulacja kiełkowania; o stymulacja rozwoju pąków bocznych i pędów przybyszowych; o tworzenie bulw; o ukorzenianie. Zastosowanie LEDów umożliwia precyzyjną kontrolę morfogenezy, biosyntezy metabolitów wtórnych i innych procesów fizjologicznych za pomocą składu spektralnego światła. •

Fotoperiod – okres oddziaływania światła na rośliny w cyklu dobowym lub rocznym, inaczej nazywany długością „dnia” i „nocy”. Wpływa on na regulację kwitnienia u roślin długiego i krótkiego dnia, regulację rytmu okołodobowego (zegara biologicznego), a także na ilość zaabsorbowanego światła i przez to na fotosyntezę oraz wzrost: • zegar biologiczny – endogenny system oscylacyjny regulujący aktywność fizjologiczną i biochemiczną umożliwiający roślinom „przewidywanie” i „przygotowanie” do pór dnia i roku. Około 30% genów wykazuje zmiany ekspresji zależne od cyklu dobowego, a głównym sygnałem środowiskowym w tym procesie jest światło odbierane przez fotoreceptory: fitochromy, kryptochromy, białka Zeitlupe. W hodowlach in vitro zazwyczaj fotoperiod składa się z 16 godzin światła oraz 8 godzin ciemności (16L/8D), co jest kompromisem dla różnych gatunków rosnących w jednym fitotronie. Niektóre typy hodowli są jednak prowadzone w świetle ciągłym (np. kultury zawiesinowe) lub w całkowitej ciemności (np. kultury kalusa). Manipulacja „kompromisowym” fotoperiodem może być również wykorzystywana do uzyskania pożądanych efektów: • długi dzień: o proliferacja pędów (również u roślin dnia krótkiego); o tworzenie pędów przybyszowych; o tworzenie grubszych i lepiej wykształconych liści; • krótki dzień: o niezbędny dla niektórych gatunków; o stymulacja organogenezy; o obniżenie kosztów, jeżeli długość dnia nie wpływa znacząco na wzrost i rozwój roślin.

Rysunek 7. Porównanie indukcji kwitnienia u roślin dnia długiego (RDD) i dnia krótkiego (RDK)....