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BIOLOGIE CELLULAIRE

Le cytosquelette C’est la charpente de la cellule. Il est composé de microtubules, de filaments intermédiaires, microfilaments. Structure : maintien de la cellule dans son environnement, positionnement des organites intracellulaires. Motricité : de la cellule dans son environnement, des organites dans la cellule.

I.

Les microtubules

Ils font 25 nm, et sont des dimères de tubuline.

A) Les tubulines Ils sont formés par la polymérisation de protéines globulaires : les tubulines. Il existe 2 types de tubulines : -

α β

α et β s’associent en dimère : hétérodimère (liaisons non covalentes). Il y a la formation d’un protofilament. L’association de 13 protofilaments pour former un tube creux et donc un microtubule  décalage des 13 protofilaments : disposition héliocoïdale, impression de « vide » à l’intérieur. Les dimères de tubuline sont polarisés, avec 1 extrémité + et 1 extrémité -. Le microtubule est donc orienté : -

Extrémité +, toujours une sous-unité β Extrémité –, toujours une sous-unité α

On va aussi avoir fixation d’un nucléotide sur α et β : -

GTP sur α (extrémité +)  GTP non échangeable GTP ou GDP sur β (extrémité -)  possibilité d’hydrolyse du GTP en GDP. Lié plutôt au GTP vers l’extrémité + et GDP au centre du MT.

B) Polymérisation-dépolymérisation C’est ce qui fait que la longueur est variable. Il y a un assemblage très dynamique et polarisé : -

Extrémité + : polymérise vite, en périphérie. Extrémité - : polymérise lentement, au centre de la cellule et proche du noyau (vers le centrosome).

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BIOLOGIE CELLULAIRE

Polymérisation est composé de 3 étapes  nucléation, élongation, équilibre. On peut représenter la polymérisation sous cette forme de représentation. On observe ce qu’il se passe dans un tube. La première étape est assez lente (association en protofilament)  nucléation, une fois faite l’élongation peut se faire très rapidement, et ensuite il y a un équilibre.

Nucléation : assemblage α + β et avec au moins 5 cofacteurs. C’est la formation du dimère αβ. Cofacteurs A à E : protéines chaperonnes (aide autres protéines à se déplacer dans l’espace).

Et formation d’un dimère avec GDP sur β : stock de dimères libres, toujours présent dans la cellule. Dans cette structure il ne peut rien se passer. Quand la concentration intracellulaire en GTP le permet :

Puis polymérisation :

Pour la stabilisation des microtubules il faut que : vitesse polymérisation > vitesse dépolymérisation. C’est pourquoi la « coiffe » GTP est très importante pour cette stabilisation. Quand β est lié au GTP  protofilament bien stable, puis hydrolyse GTP en GDP  changement conformation des sousunités et affaiblit les liaisons dans le polymère. Cela va courber le microtubule et va conduire à une dépolymérisation du MT. Lorsque le MT est trop petit il y a élongation  sauvetage.

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BIOLOGIE CELLULAIRE Même avec expériences in vitro, on peut induire la dépolymérisation des microtubules. Dans la cellule c’est tout le temps en train de polymériser et de dépolymériser.

C) Naissance des microtubules Ils naissent dans les centrosomes. Centrosomes : Centre Organisateur des MicroTubules (COMT/MTOC). C’est le site d’ancrage et de nucléation des microtubules, c’est le point de départ des MT centrosomale. C’est 2 centrioles disposés perpendiculairement. Il a été mis en évidence par biologiste allemand, et l’a appelé comme ça car Centro  centre des cellules, Soma  noyau. Chaque centrioles comportent 9 triplet de microtubules. Les triplets de microtubules sont inclinés par rapport à l’axe du centriole, le MT le plus interne est complet, les autres non. Cellule en interphase : 2 centrioles perpendiculaires, proches du noyau et les microtubules sont dispersés dans toute la cellule, avec leur extrémité – vers le noyau et leur extrémité + à la périphérie. On trouve 2 centrioles perpendiculaires proches du noyau entourés par du matériel amorphe et du matériel péricentriolaire (PCM). Il y a plus de 200 protéines dans le PCM : site de nucléation et d’organisation des microtubules.  Intervention de la γ-tubuline. Cas particuliers : organisation non centrosomale. Par exemple : -

Niveau neurones : dans axone MT centrosomaux, et dans les dendrites, ils ne démarre pas d’un centrosome. Cellules épithéliales : sur les côtés on a des MT avec extrémités - au pôle apical et des extrémités + au pôle basal.

 La tubuline γ : C’est une protéine de 454 aa avec 30% d’identité en aa avec les tubulines α et β. Elle est très conservée entre les différentes espèces. La tubuline γ humaine à 78% d’identité en aa avec celle de la drosophile et 98% avec celle du xénope. C’est une protéine essentielle à la viabilité, et a un rôle dans la nucléation des microtubules. On voit que si on ne rajoute pas de tubuline  classique. Si on rajoute de la tubuline  augmentation de la nucléation de ses MT. Il existe une association de la tubuline γ avec d’autres protéines. On va l’associer avec des Dgrips 91 et 84  γ-TuSC : γ-tubulin Small Complex. Il sert dans la nucléation pour la formation des microtubules, et sert de coiffe pour protéger leur extrémité. Quand on associe le γ-TuSC avec les Dgrips 163, 128 et 75  γ-TuRC (gamma-Tubuline Ring complex).

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BIOLOGIE CELLULAIRE  Savoir qu’il y a association avec des protéines pour stabilisation. Quand on est dans des conditions contrôle, in vitro on voit des MT, assez petits et pas nombreux. Lorsqu’on rajoute du γ-TuSC on observe une augmentation de MT, et encore plus lorsqu’on ajoute du γ-TuRC. Il faut absolument faire une quantification pour pouvoir faire une conclusion. Il existe 2 hypothèses sur les modèles de la naissance des MT : -

Modèle du moule : il s’organise en anneau et forme un moule circulaire sur lequel peut polymériser le MT Modèle du protofilament : γ-TuRC qui se met sur un microfilament.

D) Protéines MAP Ce sont des protéines associées au microtubule. Il en existe 2 types : structurales et motrices.  MAP structurales : protéines qui se fixe au MT pour les stabiliser. Il en existe 2 type  MAP de type I et les MAP de types II, plus une. o Type I : liaison des microtubules entre eux, en maintenant un espacement correct des microtubules les uns par rapport aux autres. Elles ont été historiquement mises en évidence dans le cerveau.  MAP1A, MAP1B, MAP1S. Structure globale : elles sont clivées pour pouvoir être active, elles libèrent ensuite 2 fractions. On retrouve plusieurs domaines : -

Domaine en rouge  lier au MT, appelé les MTBD (MT Binding Domain). Domain en bleu  lier à l’actine o

Type II : MAP2 et Tau  neurones, MAP4  autres tissus. MTBD au niveau terminal, et concerne les protéines Tau, peut être exprimé avec 3 ou 4 domaines.

Au niveau d’une cellule neuronale : avec les techniques d’hybridation on peut observer l’endroit des ARNm, et par IF on peut observer le lieu des protéines.

Immunofluorescence  voir la disposition des protéines les unes par rapport aux autres. Ces protéines vont permettre de stabiliser les MT sans les figer et éviter la catastrophe. Les protéines MAP2 et Tau sont capables de faire aussi beaucoup d’autres choses. Tau : se fixe sur les MT tout le long de l’axone. En se fixant elle le stabilise, mais elle peut être phosphorylée par des kinases. Cela va changer la conformation de la protéine. Elle va se retrouver

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BIOLOGIE CELLULAIRE libre et conduire une déstabilisation/dépolymérisation du MT, et accumulation de Tau. Dans le cerveau des patient d’Alzheimer, cela va produire des plaques et conduire à la mort du patient. o

+TIPs (+end TrackIng Proteins) : protéines qui ont la capacité de se fixer à l’extrémité positive.

 CLIP-170 : Cytoplasmic Linker Protein + poids moléculaire de 170kDa. Il sert à la colocalisation de CLIP-170 et des extrémités des MT. Sert à la stabilisation du MT et empêche le phénomène de catastrophe. Il existe 2 hypothèses sur l’élongation du microtubule : o Soit la protéine se fixe progressivement sur l’extrémité +, plus il augmente plus la protéine arrive (schéma de droite). o Soit la protéine se fixe un peu plus à l’intérieur du MT et est déplacée progressivement vers l’extrémité positive (schéma de gauche). Cette protéine est une protéine d’adhésions focales, proches de la vinculine, donc proche de l’actine. Ses 3 grands rôles : -

Ancrage des MT en périphérie de la cellule, permet de s’ancrer très proche de la membrane. Régulation de la dynamique des MT, s’il y a en a beaucoup, agrandissement, et quand il n’y en a pas, rétrécissement. Régulation du mouvement d’organites impliquant le complexe dynéine/dynactine,

 EB-1 (End Binding protein) : permet l’interaction entre MT et γ, mais pas avec l’actine βcytoplasmique via EB-1.  Stathmine : protéine de déstabilisation des MT. Elle se lie le long de 2 hétérodimères, et recouvre la 1ère sous-unité α. Elle va se fixer et va conduire à une incurvation des sous-unité, on a une déstabilisation et donc une catastrophe. Résumé :

 MAP motrices : il y a la kinésine et la dynéine  moteurs moléculaires, elles permettent le transport à l’intérieur de la cellule. Permettent de transformer l’énergie issus de l’hydrolyse de l’ATP en mouvement pour assurer un déplacement orienté.

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BIOLOGIE CELLULAIRE La kinésine et la dynéine comporte 2 chaines lourdes et 2 (ou plus) chaines légères.  La kinésine : c’est un complexe multiprotéiques. Il en existe 100 types issues de 14 familles (KIFs). C’est un enroulement de 2 chaines (domaine coiled coil), pour pouvoir donner une structure très stable. La conventionnelle  kinésine-1 : c’est un monomère d’une chaine lourde + une chaine légère (homodimère). La chaine lourde comporte la tête globulaire (domaine moteur), et permet un déplacement antérograde, déplacement vers l’extrémité +. Domaine de tête se fixe sur le MT et le domaine de queue fixe le cargo. Sur quelles sous-unité ? On est sensé déplacer un cargo, on part du principe que le pied avant est fixé sur une sous-unité β, et qu’il est lié à de l’ADP, il va y avoir une arriver d’ATP sur le pied avant (échange d’ADP en ATP ), il subit un changement de conformation qui va permettre au pied arrière de faire un basculement de la gauche vers la droite. C’est le changement de conformation lié à l’ATP qui permet le basculement. Le pied qui a basculer vers l’avant se fixe avec ADP sur une sous-unité β. Le pied maintenant arrière, est lié à de l’ATP et va s’hydrolyser pour avoir de l’ADP. Et ça reprends, avec un échange d’ADP en ATP au niveau du pied avant.  La dynéine : c’est un complexe multiprotéique composé de 2 chaines lourdes, 2 chaines intermédiaires et 8 chaines légères. Domaine de tête et domaine de queue. Elle est assez difficile à manipuler, avec un déplacement rétrograde, déplacement vers l’extrémité -, vers le noyau. Les dynéines cytoplasmiques sont des dimères. Domaines importants : la tige et le contrefort  structure allongée qui permet de faire le lien entre domaine qui lie le cargo et hydrolyse l’ATP et le domaine qui lie le MT. Le linker  tendance à changer de conformation. MDB  liaison avec MT. Domaine qui hydrolyse l’ATP. Peut se déplacer avec des échanges progressif d’ATP en ADP. L’hydrolyse de l’ATP conduit à un changement de conformation dans la protéine (niveau linker), et permet de transférer l’information en bas de la molécule. Lors de l’arrivée d’ATP sur la protéine, le domaine linker va changer sa conformation et entraine une inclinaison différente du contrefort, et il va faire en sorte que la fixation sur le MT va être plus faible.

Couple dynéine-dynactine : la dynéine ne fonctionne pas seule, elle fonctionne avec de la dynactine. La dynactine a plusieurs domaines important, c’est également un complexe multiprotéique. La dynéine est efficace à lier un cargo uniquement quand elle est liée à la dynactine. P150 permet de se fixer au MT, quand il se fixe, cela entraine un changement de conformation, et va permettre à la dynactine de se fixer à la dynactine.

E) Différents rôles des microtubules

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 Transport neuronal : pour faire déplacer les vésicules de NT le long de l’axone il y a les microtubules. La kinésine va pouvoir effectuer un déplacement antérograde, et la dynéine un déplacement rétrograde, pour amener des molécules en direction du corps cellulaire. Le déplacement rétrograde est 2 fois plus lent que le déplacement antérograde.  Transport de particules virales : le couple dynéine/dynactine prend en charge le virus, et le fait progresser du + vers le -, le virus va pouvoir faire entrer son matériel génétique viral. Ce transport n’est donc pas forcément uniquement positif.  Division cellulaire : Pendant l’interphase il y a réplication de l’ADN, ce qui permet aux chromosomes de s’individualiser. Dans la division cellulaire il y a l’intervention des centrosomes, ils se dupliquent, et la division les place aux 2 extrémités de la cellule, pour que la plaque équatoriale puissent se placer sur ces plaques  2 cellules filles. Les MT vont permettre aux chromosomes de s’aligner. Le centriole mère du départ donne naissance à un centriole fille, le centriole fille devient centriole mère, et le nouveau créer devient la centriole fille  centrioles néoformés. Ils se séparent durant la prophase de la mitose et viennent se placer aux 2 extrémités de la cellule. On a une première catégorie de MT : les MT astraux, ils s’organise en demi-cercle, de l’autre côté on a la même formation  il stabilisent les nouveaux centrosomes. D’autres microtubules (MT du kinétochore), ont leur extrémité + sur les chromosomes, ce qui va permettre de tirer chacune des chromatine sur la gauche ou sur la droite. L’attachement se fait sur des kinétochores. Enfin on a les MT overlap, qui vont amener leurs extrémité + un peu plus loin des chromosomes (des 2 côtés), on a des MT qui se chevauchent, et sont maintenu par des protéines  permet une forte stabilité au centre. Kinétochores : complexes multiprotéiques au niveau des centromères des chromosomes en division, il y a 2 kinétochores par centromères. Un MT du kinétochore vient s’accroche avec son extrémité + au kinétochore. Quand le MT va se dépolymériser, que cela va attirer une chromatide, et s’il se polymérise cela va dans l’autre sens. Les interactions entre MT et kinétochores se fait grâce à une protéine, et aussi avec la dynéine.  Cils : les cellules épithéliales dans la trachée sont alignées les unes avec les autres, et sont très jointives. Une cellules intestinale doit augmenter sa surface pour faciliter les échanges, il y a la présence de microvillosités. Au niveau de la trachée, c’est aussi un tissu épithélial, il y a des extensions de membrane plasmique et ce ne sont pas des microvillosité mais des cils, ils ont un rôle moteur. Les cils sont constitués de MT (ressemble au centriole). Un cil est constitué de 9 doublets de MT périphériques, et au centre il y a un doublet de MT centraux. En longitudinale  ils sont entourés de membrane (extensions de la MP), avec à l’intérieur des MT. Les cils ont des corpuscule basal (sorte de racine).

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BIOLOGIE CELLULAIRE 3 parties : l’axonème  constitué de 9 doublets de MT périphérique et 1 doublet centraux. 2 parties à l’intérieur : corpuscule basal, la racine ciliaire  pas de MT.  c’est une organisation 9+2. DONC : -

Au niveau de l’axonème on a 9 doublets périphériques et 1 doublet central. Au niveau du corpuscule basal on a uniquement 9 doublets périphériques. Au niveau de la racine ciliaire il n’y a pas de MT.

Au niveau des cils on a un rôle de déplacement, au niveau trachée, bronche, trompe de Fallope  permet un déplacement. On a des mouvement vibratiles de la gauche vers la droite, et cette vibration va permettre de faire bouger du mucus (par exemple). La dynéine sert aussi à faire bouger les MT. Entre les doublets de MT on a la dynéine qui vient se fixer. Cette fois ci c’est l’hydrolyse de l’ATP qui va permettre de la faire changer de forme, et de faire bouger les MT donc les cils. Chez les fumeur la nicotine bloque la vibration des cils, et quand ils ne fument pas, les cils reprennent une activité, ce qui fait que le mucus va être évacuer et faire tousser.  Flagelles : structure assurant la mobilité d’une cellule. Certaines cellules ont 1 seul cil, on l’a appelé le cil primaire : il est primaire et c’est un organite sensoriel (beaucoup de récepteurs à sa surface). Il porte à sa surface des récepteurs qui détectent des substances de l’environnement cellulaire (signaux chimiques, mécaniques…). La plupart des cellules de l’organisme portent un cil primaire. Il y a beaucoup de pathologies associées, il est non mobile (donc pas de doublet centraux) et a une organisation 9+0. A la surface du cil on retrouve des récepteurs pour recevoir des signaux extérieurs, et ces signaux doivent être reçu par la cellule, et donc des mouvements grâce aux MT et de la dynéine et de la kinésine. Quand les cellules sont très serrées les unes aux autres il y a un enrichissement de protéines à la surface de la cellule, le noyau va adapté une certaine structure (orientation dorsale), permet de faire pousser un cil à la surface de la cellule, grâce à une organisation du centrosomes en haut. Les cellules qui sont étendus on a plutôt un noyau avec une orientation ventral, et donc il ne peut y avoir de formation d’un cil, car le centrosome est sous le noyau.

 On a un doublet centrale lorsqu’il y a besoin d’un mouvement. Quand une cellule est au repos, certaines protéines ne doivent pas s’exprimer, il faut que leur gène ne s’exprime pas. A gauche : pas de ligand  certaines protéines ne doivent pas s’exprimer et donc que la transcription des gènes soit OFF, en amont du gène sur le promoteur on a un répresseur

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BIOLOGIE CELLULAIRE qui se fixe (Gli répresseur). La protéine Gli doit être transporté dans le cil, et devient réprimée car il n’y a pas de ligand, et vient se fixer sur la dynéine, qui prends en charge GliR et va la transporter dans le cytoplasme et cette protéine peut rentrer dans le noyau et inhiber l’expression des gènes  voie de signalisation. A droite : un ligand arrive  HedgeHog, et se fixe sur récepteur patch1, cette interaction va déplacer le récepteur Smo en haut du cil, grâce à la localisation de ce récepteur va activée la protéine Gli en GliA (activateur), puis va être prise en charge par la dynéine et va pouvoir être transportée jusqu’au noyau, où elle va se fixer sur le promoteur et va pouvoir activer le début de la transcription des gènes. La kinésine va permettre de remonter les protéines pour qu’elles se re retrouve en haut du cil.

F) Drogues agissant sur les microtubules Colchicine : isolée en 1820 de la colchique. Elle est utilisée comme anti-inflammatoire contre la goutte, pour les caryotypes et c’est un anti-cancéreux. Elle provoque une inhibition de la polymérisation des microtubules. Vinblastine : isolée de la pervenche de Madagascar, elle est utilisée comme anti-cancéreux et provoque aussi une inhibition de la polymérisation des microtubules , et agrège la tubuline dans le cytoplasme.  Se fixent entre la tubuline α et β (colchicine et vinblastine). Nocodazole : il se fixe sur une arginine de la β-tubuline. C’est un antimitotique, il y a une synchronisation des cellules en mitose. Taxol : il est produit par les champignons et extraits d’Ifs. Il bloque la dépolymérisation des MT (fixation du β). Il est utilisé en chimiothérapie (cancers poumon, sein, ovaire…). Toutes ces drogues sont aussi utilisées en laboratoire, pour bloquer les MT à un instant T.

II.

Les filaments intermédiaires

Ils sont peu dynamiques mais très résistants. Il existe différents filaments intermédiaires selon le types de cellule : -

Cellules épithéliales  kératines Cellules embryonnaires et cellules en culture  vimentine Cellules nerveuses ...