Méthodes d\'étude des constituants moléculaires de la cellule PDF

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Méthodes d'étude des constituants moléculaires de la cellule Rappels : → Microscopie photonique : la source d'énergie est le photon ; coupe ultra-fine → Microscopie électronique à transmission : la source d'énergie est l'électron ; coupe ultra-fine ; échantillon plus ou moins dense aux électrons 1. Les réactions cytochimiques Les réactions cytochimiques sont des réactions chimiques pour analyser les molécules d'une cellule. → Mise en évidence des macromolécules riches en résidus glucidiques (polysaccharides, glycoprotéines, protéoglycanes). Pour cela on fait des hydrolyses puis coloration spécifique: • Réaction APS : microscope photonique, on utilise du réactif de Schiff • Réaction au PATAg : microscope électronique Les étapes des réactions cytochimiques : – On a une coupe ultra-fine de tissu ou une culture de cellules fixées – On fait de l'hydrolyse par acide périodique (L'hydrolyse se fait sur la liaison entre deux carbones liés à des groupements OH sur le sucre. Donc formation de groupements aldéhydes) – Observations – Microscope photonique : APS : réactif de Schiff se fixe sur les aldéhydes→ coloration rouge – Microscope électronique à transmission : PATAg → Produit dense aux électrons Exemple : Coupe d'épithélium intestinal : réaction APS : les mucines sont rouges / réaction PATAg : les microvillosités et les poils sont denses aux électrons 2. La cytoenzymologie 1. Principe et protocole Le principe de la cytoenzymologie : Elle permet de détecter et de localiser dans une cellule des enzymes grâce à leur activité. Exemple : mise en évidence des phosphatases alcalines ou acide dans les cellules.

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Préparation : Fixation des cellules par traitement avec de l'alcool puis du formaldéhyde Incubation des cellules à 37° pendant 30min dans un milieu réactionnel contenant : ◦ Beta-glycerophasphate (substrat spécifique des phosphatases) ◦ Tampon de pH=9 pour les phosphatases alcalines et pH=5 pour les phosphatase acides ◦ Nitrate de plomb

Le protocole de la cytoenzymologie: On met le Beta-glycerophasphate (substrat) dans la solution. Les phosphatases (enzymes) vont faire une réaction et produire du phosphate de plomb. Le produit de la réaction est observable en : → Microscopie photonique, ajout de sulfure d'ammonium, on observe alors le sulfate de plomb de couleur brune → Microscopie électronique à transmission, on observe le phosphate de plomb dense aux électrons

3. Immunocytochimie 1. Définitions : Un antigène, Ag, est une molécule capable de provoquer une réaction immunitaire. Un anticorps, Ac, est une immunoglobuline(=protéine) qui est produite par les lymphocytes B en réponse à la présence d'une molécule étrangère(Ag). Un épitope ou déterminant antigénique est la région spécifique d'un antigène sur laquelle vient se fixer un anticorps. On peut avoir : – Des anticorps polyclonaux : c'est un mélange d'anticorps dirigés contre les différents épitopes d'un antigène. – Des anticorps monoclonaux : anticorps dirigés contre un seul épitope d'un antigène Lors de la réaction immunitaire il y a sécrétion d'anticorps spécifiques des antigènes rencontrés. 2. Réaction immunocytochimique directe Principe de la réaction immunocytochimique directe : Elle permet de localiser une molécule dans une cellule à l'aide d'un anticorps spécifique couplé à un marqueur visible sous microscope. Exemple : détection de mucines dans l'intestin humain. On doit produire les Ac anti-mucine et préparer la coupe de l'intestin humain • Production d'anticorps anti-mucines humaines Les mucines humaines doivent être considérées comme des antigènes. Injection répétée de mucines humaines à un lapin Le lapin va produire des Anticorps anti-mucines humaine On prélève le sang du lapin car le sérum contient les Ac dirigés contres les épitopes des mucines humaines (obtention d'Ac polyclonaux) – On fait un couplage chimique des Ac avec un marqueur : – Fluorochromes : → observation au microscope à fluorescence – Fluorescine = vert – Rhodamine = rouge – Marqueur particulaire : → visible en MET – Particule d'or – Particule de ferritine – Marqueur enzymatique : nécessite plus de travail car on a besoin d'un substrat en plus de l'enzyme pour avoir un produit visible au microscope – Péroxydases

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Protocole de la réaction cytochimique directe sur une coupe de tissu • Faire une coupe : ◦ Fixation ◦ Déshydratation ◦ Inclusion en paraffine → Chauffage a 60°C : inactivation des enzymes, c'est pas facile pour les tissus ◦ Coupe ultra-fine ◦ Déparaffinage ◦ Réhydratation

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Incubation de la coupe avec des anticorps marqués ◦ Les anticorps vont se fixer sur la molécule d'intérêt mais il y aura aussi des liaisons non spécifiques Lavage avec différentes concentrations d'alcool pour enlever les anticorps non fixés et ceux fixés non spécifiquement Montage entre lame et lamelle Observation sous microscope ◦ Microscope à fluorescence si utilisation de fluorochromes ◦ Microscopie photonique à lumière transmise si utilisation de marqueurs enzymatiques ou particulaires ◦ Microscope électronique à transmission possible pour les marqueurs particulaires si c'est une coupe ultra-fine

Protocole de la réaction cytochimique directe sur une culture de cellule • • • • •

Fixation de la culture de cellule pour immobiliser et ainsi faire nos réactions dessus Perméabilisation des cellules par détergent ou alcool, pour faire renter les Ac dans les cellules ← contrainte que l'on a pas avec les tissus Incubation des cellules avec des anticorps d'intérêt couplés à un marqueur ◦ Les anticorps vont se fixer sur la molécule d'intérêt Montage entre lame et lamelle Observation sous microscope adéquat 3. Réaction immunocytochimique indirecte

La réaction immunocytochimique indirecte permet de localiser une molécule dans une cellule en utilisant successivement deux anticorps. On incube l'échantillon dans un premier temps avec des anticorps non marqués pour se lier à la molécule d'intérêt. Dans un second temps on incube l'échantillon avec un second anticorps dirigé contre l'anticorps primaire. Cet anticorps secondaire est marqué. /!\ Attention, l'anticorps primaire et l'anticorps secondaire doivent être produit par deux espèces différentes pour que l'anticorps primaire sont reconnu comme un antigène par l'anticorps secondaire. Les anticorps ont une partie constante, commune à tous les anticorps, et une partie variable spécifique des antigènes vers lesquels ils sont dirigés. • Production d'anticorps primaires : – Injection répétée de la molécule d'intérêt à un lapin – Le lapin va produire des Anticorps anti-molécule d'intérêt – On prélève le sang du lapin car le sérum contient les Ac dirigés contres les épitopes des molécules d'intérêt (obtention d'Ac polyclonaux) • Production d'anticorps secondaires : – Injection répétée de la partie constante de l'Ac primaire de lapin à une souris – La souris va produire des Anticorps anti-partie constante de l'Ac primaire – On prélève le sang de la souris car le sérum contient les Ac dirigés contres la partie constante de l'Ac primaire(obtention d'Ac monoclonaux)

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On fait un couplage chimique des Ac avec un marqueur : – Fluorochromes : → observation au microscope à fluorescence – Fluorescine = vert – Rhodamine = rouge – Marqueur particulaire : → visible en MET – Particule d'or – Particule de ferritine – Marqueur enzymatique : nécessite plus de travail car on a besoin d'un substrat en plus de l'enzyme pour avoir un produit visible au microscope – Péroxydases

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Fixation de la culture cellulaire Perméabilisation des cellules Incubation avec anticorps primaires Lavage Incubation avec anticorps secondaires couplés à un marqueur Lavage Montage entre lame et lamelle Observation au microscope adéquat

Comparaison de la réaction immunocytochimique directe et indirecte : La réaction immunocytochimique indirecte à un avantage économique car on utilise plusieurs anticorps primaires puis l'anticorps secondaire marque tous les anticorps primaires ! De plus la réaction immunocytochimique indirecte permet une amplification du signal....