Método de Biuret y Bradford PDF

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Método de Biuret La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas solución de proteína precipito una coloración violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva. Precipitando a una coloración amarilla la reacción nos torna negativa al no haber presencia de proteínas. Identificación de proteínas mediante la reacción el Biuret La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos presentando un máximo de absorción a 540 nm.

Da positiva esta reacción en todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

Método Bradford Este método involucra la unión del colorante azul brillante de Coomasie G-250 a las proteínas, provocando un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm y se monitorea midiendo el incremento en la absorción a 595nm. El ensayo es muy reproducible y rápido, puede ser empleado para procesar un gran número de muestras y es adaptable a la automatización. Principio El método está basado en la observación de que el colorante azul brillante de Coomasie G-250 presenta dos formas coloreadas, azul y rojo. El color rojo pasa a azul cuando el colorante se une a la proteína. La formación del complejo colorante-proteína toma aproximadamente 2 minutos y permanece estable por 1 hora, por lo que el procedimiento es muy rápido y el tiempo para el metodo no es limitante. El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción, lo que hace al metodo cuatro veces más sensible que el método de Lowry. Inferencias Buffers altamente alcalinos presentan inferencias, pero puede ser contrarrestada corriendo blancos apropiados. Reactivos como cloruro de magnesio. Cloruro de potasio, cloruro de sodio, etanol y sulfato de amonio no tienen efecto sobre el método. Otros reactivos como tris, ácido acético, 2-mercaptoetanol, sacarosa, glicerol EDTA y tranzas de los detergentes Triton X-100, dodecil sulfato de sodio (SDS) y Hemosol tiene ligeros efectos que pueden ser fácilmente eliminados preparando buffers adecuados. La presencia de grandes cantidades de detergentes presenta una gran interferencia....