QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BRADFORD PDF

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Relatório sobre a quantificação de proteínas o relatório contém gráficos e descreve em detalhes a prática....

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

RELATÓRIO REFERENTE ÀS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO (QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BRADFORD)

AMANDA MARIA ALENCAR DE MOURA PROFESSORA – ANA LÚCIA FREITAS MATRÍCULA: 373615 CURSO: BIOTECNOLOGIA

FORTALEZA, 26 DE JANEIRO DE 2016.

INTRODUÇÃO O presente relatório tem por objetivo discorrer sobre as técnicas utilizadas para quantificar proteínas e suas vantagens. A prática ocorreu no dia 09 de novembro de 2015 no Laboratório localizado no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular DBBM. A aula foi ministrada pela professora Ana Lúcia Freitas com a assistência de duas técnicas. A prática teve o seguinte tema: Quantificação de proteínas pelo método de Bradford. O método de Bradford é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie Brilliant Blue” CBB BG250. Este método é baseado na interação entre o corante Comassie BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm. Existem, também, outros tipos de procedimentos para quantificar proteínas, entre eles estão, Biureto e de Lowry. Quando comparado aos métodos citados anteriormente o de Bradford é mais vantajoso, pois é mais rápido e sensível.

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS 

Reagente de Bradford previamente preparado;



Solução Estoque de BSA 1mg/Ml;



Água desionizada;



Espectofotômetro com comprimento de onda de 595nm;



Cubetas de plástico (próprias para absorção de luz no campo do visível);



Tubos de ensaio;



Pipetas automáticas;



Pipetas pasteur.

MÉTODOS O método de Bradford é um método simples, preciso e rápido, indicado para a detecção e quantificação de proteínas solubilizadas em meios sem detergentes. O método requer poucas etapas de misturas, não necessita de aquecimento e possui uma grande estabilidade colorimétrica. O reagente de Bradford contém como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 em solução ácida, este ao ligar-se às proteínas, tem a sua absorbância alterada de 465nm para 595nm. Esta interação entre o corante Coomassie com a proteína estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança de coloração inicialmente castanha para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína. O método de Bradford se baseia na observação da mudança de cor do corante, sendo que o complexo coranteproteína que é formado rapidamente ( aproximadamente 2 minutos) permanece disperso em solução por um tempo relativamente longo, uma hora, e tem um alto coeficiente de extinção, o que permite grande sensibilidade na dosagem das proteínas.

A absorbância, utilizando a solução com o complexo, pode ser medida em um espectrofotômetro que utiliza o comprimento de onda de 595nm (comprimento de onda de absorção máxima para o complexo). A comparação dos resultados de absorbância com uma curva padrão, com valores de concentrações conhecidos, permite a determinação da concentração da proteína em estudo. A partir de diferentes valores de absorbância, pode-se fazer a curva padrão de Bradford. No entanto, a curva padrão para dosagem de proteínas é construída utilizando-se como proteína a albumina de soro bovino. O experimento foi realizado seguindo a tabela abaixo:

TUBOS

BSA

BSA

ÁGUA

REAGENTE

(MICROGRAMAS)

(MICROLITROS)

(MICROLITRO)

DE

A 595NM

BRADFOR D

Branco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

-100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

100 -----------

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

0,470 0,140 0,256 0,238 0,387 0,440 0,623 0,625 0,711 0,840 1,039

RESULTADOS E DISCUSSÕES Os resultados obtidos não foram válidos, já que por uma falha da equipe o espectofotômetro não foi zerado com a água, tal fato refletiu nos resultados,

porém a equipe buscou um laboratório para acompanhar desde o preparo do Bradford até a construção da curva.

1.200 f(x) = 0.02 x R² = 0.99

1.000

Abs 595 nm

0.800 0.600 0.400 0.200 0.000

0

10

20

30

40

50

60

[BSA] µg/100µL

x= concentração de proteínas; y= absorbância lida.

A equação abaixa foi usada para descobrir o a e com isso aplicarmos na fórmula seguinte e obtermos o fator: Y=ax+b Obtemos as concentrações de proteínas por meio do valor que acompanha a variável x. Tal número, no caso é 0,0224 usaremos este valor para achar o fator, pela fórmula: Fator: 1/ (0,0224) = 44,64

Com o fator calculado, podemos então quantificar as proteínas, foi usada a seguinte fórmula: Quantidade de proteínas = (média das absorbâncias x Fator x D) / 100

Onde “D” equivale a quantas vezes a amostra foi diluída. O resultado dessa fórmula mensura a quantidade de proteínas em microgramas/ microlitros. Uma segunda forma de descobrir a concentração proteica é utilizando a própria equação da reta. No caso da nossa equação, temos que:

Y= 0,0224x

Onde x é a concentração de proteínas e Y a sua absorbância correspondente. Dessa forma, torna-se bem prático obter os resultados da mensuração proteica.

Com as absorbâncias anotadas a equipe pode fazer o gráfico do Bradfor, e perceber que alguns pontos estão mais próximos da curva ou estão na própria curva, indicando que não houve tantas discordâncias entre a absorbância

que

foi

lida.

Obtivemos

o

valor

de

absorbância

pelo

espectôfotometro que logo após o contato com a amostra o equipamento apresenta a numeração e assim partimos para as fórmulas e a construção do gráfico. Importante falar, também, sobre a coloração das amostras, os tubos de ensaio que continham os mesmos elementos poderiam ou não apresentar colorações marrons ou azuladas, isso indica a quantidade de proteínas naquele local, no nosso caso o tubo de ensaio.

CONCLUSÃO Esta prática auxiliou para quantificar as proteínas presentes nas soluções, o Bradford mostrou-se eficiente como já era esperado, visto que sua eficácia e precisão são relatas em artigos e livros. Porém, alguns cuidados devem ser tomados para que o experimento ocorra de modo adequado, o principal seria não expor por uma longa duração de tempo o reagente Bradford a luz, pois teríamos a perda do efeito quantificador do reagente CCB, o reagente deve ter prazo de validade no máximo de um mês (sempre observar esse parâmetro) e (mais no caso de nossa equipe) ter atenção e zerar com branco e o reagente. Portanto, a prática foi bem proveitosa, já que conhecíamos tais procedimentos, porém nunca tínhamos efetuado em laboratórios....