Metodo Bradford corretto PDF

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Metodo Bradford corretto....

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Preparazione del Campione 1. Risospendere il pellet cellulare in 50 ul di RIPA buffer. 2. Lisare le cellule eseguendo 3 cicli di congelamento/scongelamento. Ogni ciclo prevede di incubare il lisato per 2-3 min a -20°C. Si procede poi con lo scongelamento a TA. 3. Utilizzare quindi aliquote del campione (2, 4ul) per eseguirne il dosaggio utilizzando una curva standard di albumina. Dosaggio delle proteine Esistono diversi metodi di dosaggio delle proteine. 1. 2. 3. 4.

metodo di Lowry metodo del Biureto Saggio di Bradford Saggio del BCA

Ognuna delle tecniche puo’ esser impiegata in rapporto a: a. sensibilita’ b. specificita’ c. Tempo di reazione complessivo e vari tempi dell’analisi d. Tempo delle singole tappe e. interferenza tra le soluzioni impiegate per la precipitazione e la purificazione delle proteine e metodi di dosaggio delle proteine. f. Aspetto economico. Metodo di Bradford Questo metodo si basa sul legame del colorante Coomassie Brillant Blue alle proteine. A bassi valori di pH, il colorante libero ha massimi di assorbimento a 470 e 650 nm, ma quando è legato alla proteina ha un massimo di assorbimento a 595 nm. I vantaggi pratici di questo metodo sono la semplicità della preparazione del reagente, lo sviluppo di colore immediato e la stabilità. La miscela acida impiegata per dosare le proteine interagisce con i residui amminoacidici basici (arginina e lisina) presenti nella proteina, sviluppando una colorazione di intensità direttamente proporzionale alla contenuto proteico del campione in esame. Soluzione di albumina (BSA): 5 mg/10 ml

Curva di albumina

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Bianco 1 g/ml 2  g/ml 4  g/ml 8  g/ml 12 g/ml 16 g/ml 24 g/ml

BSA

H2O

--------------l l l l l l l

100 l l l l l l l l

Reattivo Bradford 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

1. Preparare 8 tubi per costruire la curva di taratura aggiungendo prima il volume di acqua e poi il volume di albumina (BSA). Trale prove deve esser inclusa la prova Bianca priva di BSA. 2. Mettere le varie aliquote di H2O dist. (riportate in tab.) nei relativi tubi numerati; 3. Aggiugere BSA secondo i valori indicati in tab.; 4. Prepare 2 tubi per il campione proteico da dosare secondo lo schema:

C1 C2 5. 6. 7. 8. 9.

Campione proteico a concentrazione incognita

H2 O

l l

98 l l

1 ml 1 ml

Aggiungere 1 ml della soluzione di Bradford ad ogni tubo e agitare le prove al vortex; Incubare 5 min le prove al buio. Lettura allo spettrofotometro (595 nm) dei singoli campioni; Riportare in grafico i valori di assorbanza e concentrazione di albumina ed estrapolare quindi la concentrazione incognita del campione di proteine.

Materiale Occorrente

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Reattivo Bradford

Protocollo Pellet cellulare (da tenere in ghiaccio!) RiPA buffer+ inibitori delle proteasi Soluzione a concentrazione nota di albumina (BSA 5 mg/10 ml). Acqua distillata tubi Carta millimetrata...