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Método de miller en español...

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Volumen 16 Número 3 1988 Investigación sobre ácidos nucleicos

Un simple procedimiento de extracción de ADN de células nucleadas humanas

S.A.Miller, D.D.Dykes y H.F.Polesky

Memorial Blood Center of Minneapolis, 2304 Park Avenue South, Minneapolis, MN 55404, USA Enviado el 18 de noviembre de 1987

Uno de los obstáculos que se han encontrado al extraer ADN de un gran número de muestras es el método engorroso de las células izadoras con los disolventes orgánicos peligrosos fenol y isocloroformo. Se han publicado varios).otros procedimientos de extracción no tóxicos, pero requieren una diálisis extensa (1) o el uso de filtros (2). Se elaboró un método rápido, seguro y barato para simplificar el procedimiento de desproteínas. Este método implica salar de las proteínas celulares por deshidratación y precipitación con una solución saturada de NaCl. Los recubrimientos de células nucleadas obtenidos a partir de sangre anticoagulada (ACD o EDTA) se resuspendieron en tubos de centralización de polipropileno de 15 ml con 3 ml de buffer de nucleiálisis. Los lisatos celulares fueron digeridos durante la noche a 37oC con 0,2 ml de 10% SDS y 0,5 ml de solución proteasa K (1 mg de proteasa K en 1% SDS y 2 mM Na2EDTA). Después de completar la digestión, 1 ml de NaCl saturado (aproximadamente 6M) se añadió a cada tubo y se agitó vigorosamente durante 15 segundos, seguido de centrifugación A 2500 rpm durante 15 minutos. El bollito de proteína precipitado se dejó en la parte inferior del tubo y el sobrenadante conector del ADN fue transferido a otro tubo de polipropileno de 15 ml. Exactamente 2 volúmenes de temperatura ambiente se añadió etanol absoluto y los tubos invertidos varias veces hasta que el ADN precipitó. Los hilos de ADN precipitados fueron eliminados con una espátula o pipeta de plástico y transferidos a un tubo de microcentrifugado de 1,5 ml que contiene 100200).l TE buffer (10 mM Tris Na-H2H2N, 0.2 m). El ADN se permitió disolver 2 horas a 37oC antes de cuantificar. El ADN obtenido de esta técnica simple produjo cantidades comparables a las obtenidas de extractos de fenol-cloroforma. Las relaciones 260/280 fueron consistentemente 1.8-2.0, demostrando una buena desproteinización. Se realizaron restricciones utilizando una serie de enzimas diferentes que requirieron concentraciones altas, medianas o bajas de sal, lo que dio lugar a restricciones completas. Este procedimiento se ha utilizado en nuestro laboratorio en varios miles de muestras de sangre para la paternidad, la población y los estudios forenses. Esta técnica se utiliza con nuestros procedimientos de hibridación no isotópica (3) que liberan todo el proceso de análisis RFLP de materiales tóxicos. REFERENCIAS: L. Longmire, J. , Albright, K., Lewis, A. , Meincke, L. y Hildebrand, C. (1987) .cidos nucleicos Res. 2. Leadon, S. y Cerutti, P.(1982) Anal. Bioquímica. 3. Dykes, D., Fondell, J., Watkins, P. y Polesky, H. (1986) Electroforesis 7, 278-282.

. 1R L Press Limitad, Oxford, Inglaterra....