Metody oznaczania białek PDF

Preview

Summary

notatki z metod oznaczania białek...

Description

Metody oznaczania białek Istnieje wiele metod pozwalających na mierzenie poziomu stężenia białek. Większość z nich opiera się na specyficznych właściwościach białek, można je rozpatrywać z punktu ich korzyści i wad. Efekt stosowania tych metod bywa różny, stąd powinniśmy poświęcić chwilę czasu na analizę, po to by wybrać tą najwłaściwszą.

Metoda Bradforda Metoda ta jest obecnie stosowana coraz częściej, głównie ze względu na prostotę oraz wysoką czułość. Coomasie Blue rozpuszczony w roztworze o pH poniżej 1 ma kolor czerwono-brązowy. Kiedy jednak wiąże się z białkiem uzyskuje kolor niebieski. Ilość białka może być dzięki temu mierzona przy długości fali 595 nm. Coomasie Blue w znacznej mierze przyłącza się do zasadowych, aromatycznych aminokwasów. Białka zawierają różną ich ilość, stąd wskazane jest utworzenie krzywej standardowej dla każdego badanego białka. Wadą tej metody jest to, że reagenty pozostają na szkle oraz plastikach laboratoryjnych. Można je stamtąd usunąć za pomocą SDS.

Reakcja biuretowa W roztworze zasadowym białka redukują jony miedzi. Uwidacznia się to poprzez niebieską barwę roztworu. Reakcję tą przeprowadza się najczęściej w obecności glikolu polietylenowego. Minusem tej metody jest to, że powinniśmy ją stosować głównie do roztworów, w których mamy dużą ilość białka, ponieważ nie jest zbyt czuła. Poza tym TRIS może zafałszowywać wynik tej reakcji. Inną, mniej znaną modyfikacją tej metody jest micro-biuret assay.

Metoda Lowry’ego Metoda ta jest modyfikacją metody biuretowej. Podobnie jak w metodzie biuretowej tworzą się tutaj kompleksy miedziowo-białkowe. Jony miedziowe są następnie redukowane reagentem FolinCiocalteu, powodując powstanie intensywnej niebieskiej barwy. W porównaniu z metoda biuretową ta jest dużo bardziej czuła oraz powoduje zużycie znacznie mniejszej ilości próbki. Metoda ta jest jednak dużo bardziej skomplikowana.

Metoda z kwasem bicinchoninowym Metoda ta jest kolejną modyfikacją reakcji biuretowej. Kwas bicinchoninowy tworzy z jonami miedziowymi stabilny kompleks, który maksimum absorbancji posiada przy 562 nm. Metoda ta jest czulsza od metody biuretowej i metody Lowr’ego oraz mniej wrażliwa na warunki zewnętrzne. Podobnie jak pozostałe metody oparte na reakcji biuretowej metoda ta wrażliwa jest na obecność związków redukujących np. kwasu askorbinowego.

Absorbancja w UV Absorbancja jest chyba najprostszą metodą do mierzenia koncentracji białka w roztworze. Białka absorbują najlepiej przy długości fali - 280 nm. Dzieje się tak z powodu zawartości aromatycznych aminokwasów, takich jak tryptofan czy tyrozyna. Natomiast przy 185 nm znajduje się szczyt absorbancji białek, który wynika z obecności wiązań peptydowych. Ekstynkcja białek przy 280 nm jest różna z powodu różnej zawartości aminokwasów aromatycznych, natomiast poniżej 220 nm w przypadku obecności różnych białek nie pozwala na ich rozróżnienie. Poza tym trudno jest zmierzyć absorbancję białka w obszarze około 185 nm ponieważ rózne formy tlenu również absorbują na tym obszarze. Współczynniki ekstynkcji białek są różne, zatem absorbancję w UV należy raczej traktować jako metodę jakościową, oczywiście z wyjątkiem oczyszczonych już białek, dla których współczynniki ekstynkcji są już znane. Jedną z wad tej metody jest to, że wiele innych związków chemicznych obecnych w próbce powoduje zafałszowanie wyników. Dzieje się tak np. w przypadku kwasów nukleinowych. Wprawdzie maksimum absorpcji tych związków znajduje się przy 260 nm, ale po części również zafałszowują wynik przy 280 nm.

Aminokwasy – budowa •

Zawierają co najmniej po jednej grupie aminowej i karboksylowej

•

Mogą zawierać dodatkowe grupy: o Hydroksylowa o Wodorosiarczkowa o Pierścień aromatyczny o Pierścień heterocykliczny

Białka • • • • •

Wszystkie organizmy zawierają białko Każdy organizm wytwarza własne białka Podstawowe składniki białek – aminokwasy Roślinne – mogą wytwarzać aminokwasy ze związków nieorganicznych azot mineralny → w organiczny Zwierzęce – muszą przyjmować gotowe aminokwasy z pożywieniem

Białka – klasyfikacja wg. Składników • •

Białka proste - zbudowane z samych aminokwasów (co najmniej 100 aminokwasów) Białka złożone - Aminokwasy + składnik niebiałkowy

Białka – wg. kształtu cząsteczki •

•

Globularne – kształt eliptyczny o łatwo rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli o białka czynne biologicznie (enzymy, antygeny, przeciwciała) Fibrylarne (włókienkowe) – kształt znacznie wydłużony o Bardziej trwała struktura – nierozpuszczalne o Białka strukturalne i podporowe (keratyna, miozyna, kolagen)

Struktura białek •

•

•

•

•

Pierwszorzędowa o kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym o Kolejno po sobie następują grupy: aminowa, węgla α (C-2) z wystającymi na zewnątrz resztami aminokwasów, karboksylowa o Utrwalona wiązaniami kowalencyjnymi Drugorzędowa o prawej śruby (α-heliksu) o struktury pasmowej o Stabilizacja – wiązania wodorowe (wodór-azot; wodór-tlen) słaba siła ale dużo Trzeciorzędowa – dotyczy b. globularnych o Sposób pofałdowania i zwinięcia heliksu w przestrzeni o Utrwalenie ▪ wiązania wodorowe oraz jonowe pomiędzy resztami kwasowymi i zasadowymi ▪ Wiązanie sulfidowe S-S ▪ Wiązania izopeptydowe o Sfałdowanie liniowego łańcucha jest procesem spontanicznym o Zależy od charakteru i sekwencji aminokwasów o Zachowanie naturalnej struktury drugo- i trzeciorzędowej konieczne do zachowania biologicznych właściwości białek Struktura trzeciorzędowa b. włókienkowych o Mniej skomplikowana – dodatkowe zwinięcie kilku łańcuchów polipeptydowych względem siebie w postaci „liny okrętowej” Struktura czwartorzędowa o Występuje dla białek, złożonych z kilku łańcuchów polipeptydowych o Tworzą oligomery

Konformacja białek • •

Ukształtowanie przestrzenne (struktura drugo- i trzeciorzędowa)

Funkcje białek •

•

Funkcje w organizmie o Strukturalna – kolagen, elastyna, miozyna, aktyna, białka błon o Osłonowa (białko jedwabiu-fibroina) o Transportowa – hemoglobina o Odpornościowa – globulina, fibrynogen o Hormonalna – insulina o Enzymatyczna – pepsyna, trypsyna o Zapasowa – prolaminy Klasyfikacja białek wg funkcji o Proste: ▪ Albuminy • Białka cieczy ustrojowych, oraz nasion roślin uprawnych • Rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli o Albumina surowicy krwi, mleka o owoalbumina jaja o rycyna nasion rącznika o leukozyna ziarna zbóż • Regulacja ciśnienia osmotycznego cieczy ustrojowych • Wiązanie składników odżywczych i regulacyjnych ▪ Globuliny • Najważniejsza i najpopularniejsza grupa białek - większość enzymów • Nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczalne w roztworach soli • Występują” o Płyny ustrojowe (procesy odpornościowe) o Białka zapasowe nasion bobowatych ▪ Protoaminy • Najprostsze białka (zbudowane z 8 rodzaju aminokwasów) • Nie zawierają aminokwasów siarkowych • Charakter silnie zasadowy ▪ Histony • Łączą się z kwasem deoksyrybonukleinowym – typowe białka jąder komórkowych tworzą nukleoproteiny • Charakter silnie zasadowy ▪ Prolaminy • Białka zapasowe nasion roślin jednoliściennych • Rozpuszczalne w rozcieńczonych niższych alkoholach alifatycznych ▪ Gluteiny • Białka zapasowe nasion roślin jednoliściennych • Rozpuszczalne w rozcieńczonych kwasach i zasadach ▪ Skleroproteiny • Białka fibrylarne • Funkcje podporowe (np. keratyna, kolagen, elastyna) • Składniki tkanki łącznej i strukturalnej zwierząt • Odporne na działanie rozpuszczalników

o

Złożone: ▪ Glikoproteiny • Aminokwasy + cukry • Składniki cieczy ustrojowych i białek błonowych, enzymy, hormony • Odpowiadają za rozpoznawanie ciał obcych (przeciwciała) • Podstawowy składnik substancji grupowych krwi ▪ Chromoproteiny • Aminokwasy + barwniki • Niejednorodne chemicznie • Hemoglobina, mioglobina ▪ Lipoproteiny • Aminokwasy + lipidy • Występują w błonach komórkowych, cytoplazmie • Odpowiadają za transport lipidów, hormonów i witamin w tłuszczach • Wyst. w żółtku jaja ▪ Nukleoproteiny • Aminokwasy + kwasy nukleinowe • Występują w jądrach komórkowych oraz rybosomach • Budulec wirusów ▪ Fosfoproteiny • Aminokwasy + reszta kwasu fosforowego • Substancje zapasowe i odżywcze • Np. kazeina mleka, witelina żółtka jaja

Peptydy •

Związki powstałe przez połączenie dwóch lub więcej aminokwasów za pomocą wiązania peptydowego

•

Umowny i przybliżony podział peptydów o Dipeptydy – 2 aminokwasy o Tripeptydy – 3 aminokwasy o Oligopeptydy - 2-10 aminokwasów o Polipeptydy - 11-100 aminokwasów o Makropeptydy - ponad 100 aminokwasów – białka...