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TECNICA DE MICROCULTIVO DE HONGOS. LOS MICROCULTIVOS FUNDAMENTO: Procedimiento que permite la observación e identificación de las estructuras microscópicas de hongos filamentosos que se distinguen con facilidad sin distorsión, alteración o rompimiento de las mismas. Esto pasa cuando el hongo se desarrolla directamente bajo el portaobjetos. Forma parte de las pruebas para identificar el género y la especie de los hongos, permiten hacer el seguimiento del desarrollo de los mismos. Los cultivos en placa se obtienen sembrando por picadura el centro de las cajas que contienen diferentes medios. TINCIÓN DE AZUL DE LACTOFENOL Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada en la afinidad del colorante por componentes de las células, en este caso por las estructuras fúngicas. El azul de lacto fenol tiene tres características que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. El fenol destruye la flora acompañante (en los cultivos, pueden crecer colonias de bacterias) El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear, por decirlo de algún modo, una película que las protege provocado por un cambio de gradiente osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura. El azul de algodón tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos microscópicos TINCION CON ROJO CONGO. Realice una preparación temporal de hongos, usando lacto fenol en lugar de agua para colocar el micelio. Coloque el cubreobjetos y por un extremo agregue una gota de rojo Congo*, permita que se difunda y observe al microscopio. •Esta técnica se puede seguir, sustituyendo colorantes. Sirve, sobretodo, como indicador del pH, es decir, de indicador de la acidez de un medio. En su forma básica el rojo Congo es rojo. Cuando el pH está comprendido entre 3.0 y 5.2 se vuelve rosa. En presencia de una acidez superior este indicador se vuelve azul

Bibliografía 1. Barne, H., and Hunter, B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi. MacMillan Publishing Company. 218 pp. QK 625 D1 B3

METODO/TINCION.

UTILIZACION.

COMENTARIOS.

Blanco calcofluor

detección de todos los hongos, entre ellos Pneumocystis jiroveci (carinii)

Rápido (1/2 min); detecta quitina de pared fúngica por fluorescencia brillante. Empleada en combinación con KOH. Precisa de un microscopio de fluorescencia con filtros adecuados. La fluorescencia de fondo puede dificultar el estudio de algunas muestras.

Tinción de Gimsa

Examen de medula ósea, frotis de sangre periférica, preparaciones hiticas touch, y muestras respiratorias.

detecta formas intracelulares de Histoplasma capsulatum y formas tanto intraquistica como troficas de P. jiroveci (carinii).

Detección de bacterias y hongos

Se realiza con frecuencia en las muestras clínicas. Tiñe la mayor parte de las levaduras y las hifas presentes en las mismas. Casi todos los hongos son Gram positivos, aunque algunos muestran un patrón moteado o aparecen como Gram negativos, como Cryptoccus neoformans.

Tinción histológica con fines generales.

tinción más adecuada para mostrar la reacción en el tejido infectado. Tiñe casi todos los hongos, aunque puede resultar complicado diferenciar del fondo la presencia de un numero bajo de microorganismos. Es útil para revelar el pigmento natural de los dermatiaceos.

Tinción de Gram

Hematoxilina. Eosina.

Metanamina argentica de Gomori

tinción más adecuada para detectar hongos. Tiñe las detección de hongos en cortes hifas y las levaduras adoptan una coloración negra frente histológicos y quistes de P.jirovecci a un trasfondo verde. Suele realizarse en el laboratorio (carinii) en muestras respiratorias de anatomopatologia.

Murcicarmina

resulta útil para mostrar la presencia de material capsular de Cryptococcus neoformans. También puede teñir las paredes celulares de Blastomyces dermatitidis y Rhinosporidium sieberi.

tinción anatomopatologica de mucina

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Ácido peryodico de Schiff (PAS)

tinción histológica de hongos

tiñe tanto levaduras como hifas en los tejidos. Los artefactos positivos para esta tinción pueden remedar células de levadura.

Adaptado de Pfaller MA, McGinnis MR: The laboratory and clinical mycology. In Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA: Clinical Mycology, New York, 2003, Churchill Livingstone.

TECNICA Y FUNDAMENTO. De las pruebas fisiológicas y bioquímicas se han derivado los ensayos de asimilación (auxonograma - degradación aerobia) y fermentación (zimograma - degradación anaerobia) de carbohidratos para la identificación de levaduras. AUXONOGRAMA CONVENCIONAL Se fundamenta en la aplicación por separado de diferentes nutrientes, hidrocarbonados o nitrogenados, sobre un medio sintético base para apreciar el crecimiento selectivo de una levadura en la cercanía de los nutrientes necesarios para su desarrollo. Para su realización pueden emplearse soluciones acuosas esterilizadas por filtración, cilindros de Oxford en pocillos hechos en el agar o bien discos de papel absorbente empapados con el nutriente. Sin embargo, las pruebas de asimilación en medios líquidos no ofrecen ninguna ventaja adicional sobre los medios sólidos, resultando mucho más laboriosas y costosas. Medios de cultivo base. Se prepararan según la técnica habitual y no necesitan ajustar el pH. Se expenden deshidratados como medios base de levaduras. Los más utilizados son los siguientes: 1. Medio sin carbono. Sulfato amónico (5 g/l), Fosfato mono potásico (1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l). 2. Medio sin nitrógeno. Glucosa (20 g/l), Fosfato mono potásico (1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l). Como fuente de carbono se puede ensayar todos los azúcares y alcoholes conocidos. Como substrato de nitrógeno se suele emplear peptona, asparagina, urea, sulfato amónico, nitrato de potasio y aminoácidos diversos. Como fuente de carbono se pueden emplear todos los azúcares y alcoholes. Como sustrato nitrogenado se puede usar peptona, asparagina, úrea, sulfato de amonio, nitrato de potasio y aminoácidos diversos. Procedimiento

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1. La levadura en estudio se siembra previamente en caldo glucosado de Sabouraud más cloranfenicol a 28 °C durante 48 h. 2. Agitar para mezclar el cultivo y tomar 1 ml como inóculo del medio sintético fundido. Enfriar a 50 °C, mezclar y verter en placa. 3. Preparar las soluciones estériles de los nutrientes, los azúcares al 10% y las sustancias nitrogenadas al 1%. 4. Una vez solidificado el agar, y con la ayuda de un tubo de cristal, agujerear 56 pocillos por placa. Sobre cada pocillo se vierten dos gotas de los distintos nutrientes en estudio. 4. bisSi se utilizan discos de papel absorbente, deben confeccionarse de distintos colores o rotularse previamente. Una vez esterilizados, y antes de su empleo, se empapan con dos gotas de las soluciones acuosas de los nutrientes (al 20% para los azúcares y al 2% para los substratos nitrogenados). Se secan en estufa y se aplican sobre el medio con pinzas estériles. 5. Incubar a 28 °C. (2-4 días). Interpretación • En la zona circulante a los pocillos o los discos, crecen abundantes colonias de levaduras si utilizan el nutriente correspondiente; por el contrario, no aparecen en los contornos de los no utilizados. • La intensidad del cultivo periférico se expresa mediante cruces: 5 mm de radio (+), 5-10 mm (++), >10 mm (+++).

ZIMOGRAMA Es un método que permite determinar en un gel de acrilamida nativo (sin desnaturalizar) cuál de las proteínas presentes en la muestra es la que tiene una actividad enzimática especifica; eso requiere utilizar sustratos específicos para la enzima en cuestión. Una vez efectuada la separación de las proteínas que componen una muestra compleja, ésta se pone en contacto con el sustrato, permitiendo que se lleve a cabo la reacción. Para visualizar la banda que está produciendo la reacción se utiliza un colorante como indicador, el cual puede estar basado en el cambio de pH producido por el metabolito de la reacción que la enzima esté realizado, o bien puede llegar a producirse como metabolito una molécula que tenga color propio.

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Las lipasas son enzimas triacilglicerol acilhidrolasas (EC 3.1.1.3) que son capaces de hidrolizar los triglicéridos, generando como metabolitos los ácidos grasos libres y la molécula del glicerol. Utilizando el cambio de pH en la zona de reacción, se pueden observar las zonas que corresponden a la banda que tiene la actividad enzimática. Procedimiento 1. Elaborar dos geles no desnaturalizantes, para lo cual se preparan los geles de poliacrilamida al 12 % y se sustituye el SDS por agua destilada. 2. Se elaboran dos geles idénticos, uno se teñirá con azul de Coomassie (como se ha trabajado previamente en las prácticas anteriores) y el otro se utilizará para realizar el zimograma. 3. Las muestras se preparan sin adición de SDS ni agente reductor (DTT o β-mercaptoetanol), es decir, sin el buffer desnaturalizante. 4. La corrida electroforética se hace con un buffer de migración que no debe contener SDS. 5. La migración se lleva a cabo a 80 V durante 3 horas o hasta el momento en que el frente de corrida emerja del gel. Durante la migración se recomienda mantener la cámara de electroforesis fría, para lo cual puede colocarse dentro del refrigerador o bien dentro de un recipiente con hielo. Esto, con el fin de evitar un aumento en la temperatura que pueda ocasionar una desnaturalización o modificación en la estructura de las enzimas. 6. Una vez finalizada la electroforesis, los geles deberán desmontarse y colocarse de manera individual en recipientes; en el gel que será teñido con azul de Coomassie se sigue la técnica de la práctica anterior y el otro gel se coloca con agua destilada, manteniéndolo en agitación por 1 hora a temperatura ambiente y haciendo cambios de agua cada 20 minutos. 7. Para la búsqueda de actividad lipasa, se prepara una solución de tributirina (TC4) 0.25 % p/v y rojo de fenol 0.01 % p/v en MOPS 2.5 mM, pH 6.8 y 0.15 % de NLS (N-laurilsarcosina). El pH se ajusta a 6.8 para tener una mejor definición del color. Para una homogeneización total de la solución, utilizar el vórtex. 8. Después de ser lavado con agua destilada, el gel para el zimograma se sumerge en la solución con el sustrato y el colorante hasta que se observen bandas de color amarillo, que serán indicativas de actividad lipasa. 9. Colocar el gel en el transilumidor de luz blanca y tomar una fotografía con el foto documentador. 10.Hacer una comparación de los 2 geles, en el gel teñido con azul de Coomassie se observarán todas las proteínas que componen la muestra, mientras que en el gel del zimograma se observarán sólo las bandas que posean actividad lipasa.

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VILATA CORELL, J. (2006). Micosis cutáneas. [online] Google Books. Available at: https://books.google.com.mx/books? id=ML5kocizMKgC&pg=PA118&lpg=PA118&dq=tecnica+y+fundamento+del+auxonograma&source=bl&ots=W7OKH7HtG C&sig=VxmhJ0Mhzr1fG0IRBym57QGaJEs&hl=es&sa=X&ved=0CDgQ6AEwBGoVChMIgvXcrbiHyQIVUsBjCh1YtAgu#v= onepage&q&f=true [Accessed 11 Nov. 2015]. P.118

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ESTRUCTURA MICROSCOPICA Y COLONIAL. Morfología colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el diámetro oscila entre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cóncavas de aspecto brillante o mate, opacas, de bordes lisos. Morfología colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de diámetro, de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado, algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares. Morfología microscópica: La morfología microscópica se observa con la ayuda del microscopio a seco fuerte mediante la realización del micro cultivó, observándose las siguientes estructuras: DERMATOFITOS. Complejo de entidades causadas por algunos hongos filamentosos relacionados desde el punto de vista taxonómicos que pertenecen a los géneros: A. Trichosporon. B. Epydermophyton. C. Microsporum. Patrón de crecimiento en cultivo: IN VITRO GENERO Epidermophyton

Microsporum

Trichophyton

MACROCONIDIAS.

MICROCONIDIAS.

Pared lisa, reunidas en Ausentes grupos de dos o tres. Abundantes, grafología macroscópica: en Infrecuentes tamaño, pared gruesa y rugosa. Infrecuentes, lisas, pared delgada.

Abundantes, esféricas, piriformes.

INVASION

CABELLO IN VIVO. FLUORESCENCIA en lámpara de Wood.

No aplicable

No aplicable.

Ectotrica

(M.gypseum no emite fluorescencia)

Endotrica

(T. schoenlinii emite fluorescencia)

Tipo de Infección. Zoonoticas: Principal anfitrión. Epidermophyton flocosum Microsporum canis

Tiña del Tiña Tiña Tiña de pie corporal inguinal la barba x

gato, perro y caballo.

Microsporum gypseum Trichophyton tonsurans Trichophyton mentagrophytes

roedores.

x

Onicomicosis x

x

x

x

x

x

x

x

x

x

Trichophyton mentagrophytes. 7|Page

Morfología macroscópica: La variedad granulosa desarrolla colonias de crecimiento rápido en un plazo de 8 a 10 días, planas, de color crema o amarillentas, de aspecto pulverulento y con anillos concéntricos. Se observa un color marrón claro en el reverso, aunque algunas cepas presentan un color rojo y oscuro. La variedad interdigitales desarrolla colonias planas y blancas, que con el tiempo se tornan amarillentas, pudiendo ser el reverso amarillento o marrón. Tienen un aspecto densamente velloso o algodonoso. Morfología microscópica. Se observan hifas sentadas, con formaciones en espiral, pequeños micro conidios esféricos de 2 a 3 mn.de uvas.los macroconidios tienen forma de lápiz de 3 a 6 septos. En la variedad granulosum los microconidios y las hifas en espiral son abundantes y los macroconideos de 40 a 60 mn tienen de cuatro a seis septos y sus escasos. Trichophyton tonsurans. Morfología macroscópica: inicialmente y con mayor frecuencia se desarrolla una colonia plana, poco purulenta, de color amarillo en la superficie y con un color rojo caoba en el reverso. Posteriormente se vuelve plegada, de superficie con un color crema grisáceo o marrón, y al reverso la colonia desarrolla un pigmento ocrerojizo oscuro que difunde al medio. Algunas cepas son menos purulentas y presentan una colonia de color blanco, amarillo pálido o intenso. Morfología microscópica: se observan microconidios, generalmente abundantes y de tamaño variable, en forma de mazo, de lagrima o forma irregular, con paredes gruesas, que nacen de hifas ramificadas o terminales y que se nacen de hifas ramificadas o terminales y que se disponen en algún recto con respecto a estas. Tienen tendencia a aumentar de tamaño, dando lugar a estructuras en forma de clava o de balón. Microsporum canis.

Morfología macroscópica: la colonia es de rápido crecimiento, con tendencia a ser plana. Blanca o amarillenta, tosca vellosa o algodonosa, disperso, con bordes radiales y con un color amarillo intenso o anaranjado al reverso.

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Morfología microscópica: se encuentran macro conidios en abundancia, largos, en forma de huso, de paredes gruesas, con una prominencia asimétrica apical en donde es más evidente la superficie rugosa (espículas) de estas estructuras, y casi siempre con más de seis compartimentos. Hay escasos micro conidios piriformes o en forma de clava, no diagnósticos de la especie. También pueden obser varse hifas en raqueta, cuerpos pectrinados y clamidocondios. Microsporum gypseum. Morfología macroscópica: la colonia es de rápido crecimiento, plana, pulverulenta, con aspecto y textura de piel de ante, de color canela y algunas veces con tonos de color violeta. El reverso puede presentar o no pigmento de color variable. Morfología microscópica: se observan macroconidios en abundancia, simétricos, elipsoidales, de superficie rugosa o equinulada, de paredes relativamente delgadas, de cuatro a siete compompartimento y agrupados en racimos. Pueden encontrarse microconidios en forma de mazo, pero no son diagnóstico. Epidermophyton floccosum. morfologia microscopica: Hongo filamentoso que forma abundantes macroconidios (de 20-40 mn x 6-12 mn) en forma de maza dispuestos en racimos, con una pared gruesa y lisa, con extremos romos, que presentan de dos a cuatro septos. los macroconidios se asientan sobre el conidioforo por un pequeño pediculo. microconidios ausentes. hifas en raqueta y clamidosporas en cultivos viejos. morfologia colonial: colonias visibles a los 7 - 9 dias, como un mechon de hifas amarillentas (colonias de 2-3 cm de diametro a los 20 dias), con aspecto aterciopelado, finalmente pulvurulento, planas, con centro umbilicado del que parten surcos radiales y color de verde amarillento a verde oliva. la zona marginal termina en una corona radial blanca. el reverso es amarillento con un centro naranja o amarillo parduzco. las colonias se blanquean rapidamente y se vuelven flocosas y esteriles.

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