Ocena-biozgodności - ocena biozgodnosci PDF

Preview

Summary

ocena biozgodnosci...

Description

1. Wstęp teoretyczny:

2. Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia było przeanalizowanie procedury badań in vivo włącznie z przygotowaniem preparatów histologicznych, zapoznanie się z metodyką oceny wcześniej wspomnianych preparatów oraz ich analiza na granicy implant-tkanka po implantacji. 3. Procedura: 3.1.

Przygotowanie preparatów:

Przygotowanie preparatów do badań histologicznych to proces wielostopniowy, którego celem jest otrzymanie trwałego, zabarwionego kawałka narządu lub tkanki o takiej wielkości, która umożliwi jego analizę przy użyciu mikroskopu świetlnego. Proces ten dzieli się na następujące etapy:  pobieranie tkanki- ma miejsce w czasie sekcji,  wybieranie wycinków- krojenie pobranego wycinka na mniejsze kawałki,  utrwalanie tkanki- wprowadzenie tkanki do płynu utrwalającego, najczęściej do formaliny; czas tego procesu zależy od rodzaju tkanki, utrwalacza i wielkości wycinka,  usunięcie utrwalacza,  odwodnienie tkanki i jej oczyszczenie- proces ten musi przebiegać stopniowo, aby nie spowodować obkurczenia i uszkodzenia organelli, a co za tym idzie zniszczenia preparatu; proces ten polega na umieszczaniu tkanki w roztworach etanolu o wzrastającym stężeniu od 50% po 99,8%, aż do mieszaniny etanol-ksylon i czystego ksylonu;  zatopienie w parafinie- tkanki ludzkie i zwierzęce należy utrwalać ze względu na to, że są miękkie, co uniemożliwia ich bezpośrednie pokrojenie na bardzo cienkie skrawki; parafina jest stosowana do tego zabiegu ze względu na to, ze jest to materiał biochemicznie obojętny i łatwo skrawalny;  wykonanie preparatów- krojenie obiektu biologicznego zatopionego w parafinie na skrawki o ustalonej grubości, a potem naklejanie go na szkiełka podstawowe;  barwienie- etap, podczas którego z preparatu usuwana jest parafina oraz preparat jest nawadniany; barwienie ma na celu pokazanie ogólnej budowy komórkowej danego obiektu oraz określonych elementów biostruktury;  przykrycie szkiełkiem nakrywkowym- aby uczynić preparat trwałym ponownie się go odwadnia, a następnie nanosi się na jego powierzchnię krople medium zamykającego i umieszcza na nim szkiełko nakrywkowe;

3.2.

Barwienie:

W trakcie laboratorium obserwowaliśmy próbki, które były barwione za pomocą dwóch metod: przy użyciu hematoksyliny i eozyny (H+E) oraz metoda Massona. Barwienie hematoksyliną i eozyną - jest to najbardziej popularna metoda barwienia preparatów histologicznych. Jest to barwienie przeglądowe. Polega na potraktowaniu preparatu hematoksyliną (wybarwia zasadochłonne struktury), przepłukaniu go wodą i potraktowanie go eozyną (wybarwia kwasochłonne struktury). Procedura tego procesu przebiega w następujących etapach:  kąpiel w kuwecie z hematoksyliną (7-10 minut),  kąpiel w kuwecie z wodą destylowaną,  płukanie pod bieżącą wodą,  ponowna kąpiel w wodzie destylowanej,  kąpiel w kuwecie z 1% eozyną z dodatkiem kropli kwasu octowego,  kąpiel w wodzie destylowanej. Barwienie za pomocą metody Massona- służy do wykrywania i różnicowania włókien mięśniowych, nerwowych i kolagenowych. Barwniki wykorzystywane do tego procesu to hematoksylina żelazista, fuksyna i błękit anilinowy. Przebiega w następujących etapach:  płukanie w wodzie destylowanej i umieszczenie w płynie Bouina (12 godzin),  przemycie pod wodą bieżącą,  barwienie w roztworze hematoksyliny,  płukanie w wodzie destylowanej i pod woda bieżącą,  barwienie w fuksynie,  ponowne płukanie w wodzie destylowanej,

  3.3.

barwienie w roztworze błękitu anilinowym, włożenie preparatów na 2 minuty do 1% roztworu kwasu octowego. Specyfikacja preparatów:

Metoda H+E:  jądro- niebieskie/granatowe  włókna kolagenowe- różowe  erytrocyty- ceglastoczerwone  cytoplazma- bladoróżowa  włóknik- ciemnoróżowy Metoda Massona:  włókna kolagenowe- niebieskie  jądro- czarne  włóknik- czerwony  cytoplazma- ceglastoczerwona

4. Wyniki: Badaniom zostały poddane próbki pochodzące z tkanki około implantacyjnej oraz ze śledziony. Materiałem implantowanym była stal AISI 316 LVM oraz stal AISI 316 LVM pokryta powłoką węglową.

Zdjęcie 1.Tkanka, grupa kontrolna, 24h, H+E, pow. 50x

Zdjęcie 2.Tkanka, stal AISI 316LVM, 24h, H+E, pow. 50x

Zdjęcie 3.Tkanka, stal + DLC, 24h, H+E, pow. 40x

Powyższe fotografie pokazują zmiany w strukturze tkanki po wszczepieniu implantu ze stali oraz ze stali z powłoką węglową. Dzięki barwieniu hematoksyliną i eozyną widzimy różnice w rozmieszczeniu jąder komórkowych, które barwią się na ciemnoniebiesko i różowej cytoplazmy. Na zdjęciu 1 tkanka jest jednolita i nie posiada zwłóknień. Przy dwóch następnych próbkach występuje obrzęk i stan zapalny, większy dla implantu nie pokrywanego wcześniej powłoką. Świadczy o tym bardziej intensywny kolor czerwony występujący na zdjęciu 2.

Zdjęcie 4. Tkanka, grupa kontrolna, 24h, TM pow. 50x

Zdjęcie 5. Tkanka, stal AISI 316LVM, 24h,TM pow. 50x

Zdjęcie 6.Tkanka, stal + DLC, 24h, TM, pow. 40x

Barwienie z wykorzystaniem metody Trichrom-Masson umożliwiło porównanie liczby włókien kolagenowych w każdym z preparatów. Na zdjęciu próby kontrolnej włókna są ciemnoniebieskie, możemy stwierdzić, że w tkance występuje duża ich ilość. W przypadku zdjęcia 5 włókna kolagenowe mają jaśniejszą barwę i jest ich znacznie mniej w porównaniu do poprzedniej próbki. Dla organizmu z zaimplantowanym metalem pokrytym DLC występuje więcej włókien niż dla samego metalu. Na zdjęciu 6 obserwujemy naturalne przekrwienia w postaci małych, czerwonych plamek, natomiast na zdjęciu wcześniejszym są one większe i bardziej widoczne.

Zdjęcie 7. Śledziona, grupa kontrolna, 24h, H+E pow. 40x

Zdjęcie 8. Śledziona, stal AISI 316LVM, 24h, H+E pow. 40x

Zdjęcie 9.Śledziona, stal + DLC, 24h, H+E, pow. 40x

W śledzionie barwionej metodą HE również możemy zaobserwować znaczące zmiany. Na pierwszej fotografii widzimy naczynia krwionośne oznaczone na różowo, natomiast na kolejnych zdjęciach nie są one wyraźnie widoczne. Kolorem niebieskim zabarwiona jest miazga biała, a czerwonym – miazga czerwona. Obydwa zdjęcia - 8 i 9, charakteryzują się intensywnie czerwoną barwą, która świadczy o przekrwieniu. Większe przekrwienie występuje dla organizmu z wszczepionym implantem bez powłoki.

Zdjęcie 10.Tkanka, grupa kontrolna, 6 mies, H+E, pow. 50x Zdjęcie 11.Tkanka, stal AISI 316LVM, 6 mies, H+E, pow. 50x

Zdjęcie 12.Tkanka, stal + DLC, 6 mies, H+E, pow. 40x

Podobnie jak na zdjęciu 1 tkanka grupy kontrolnej zbadana po 6 miesiącach ma jednolitą strukturę a jej komórki rozmieszczone są równomiernie o czym świadczy układ jąder i cytoplazmy. Dla organizmu z wszczepionym implantem ze stali obserwujemy czerwone, niewielkie ogniska stanu zapalnego w małej ilości. Jego całkowity brak możemy zauważyć na zdjęciu 12, dla implantu pokrytego powłoką. W tkance występują zwłóknienia zabarwione na kolor ciemnoróżowy, a komórki mają normalne ułożenie.

Zdjęcie 13. Tkanka, grupa kontrolna, 6 mies, TM pow. 50x

Zdjęcie 14. Tkanka, stal AISI 316LVM, 6 mies,TM pow. 50x

Zdjęcie 15.Tkanka, stal + DLC, 6 mies, TM, pow. 40x

Na zdjęciach 13-15 możemy porównać ilość włókien kolagenowych dla próbek badanych po 6 miesiącach od operacji. W grupie kontrolnej występuje ich najwięcej, a jego kolor jest ciemnogranatowy. Natomiast najmniej kolagenu posiada tkanka z implantem ze stali z powłoką DLC. Na zdjęciu 14 obserwujemy naturalne rozłożenie komórek zabarwionych na czerwono, na fotografii 15 nie są one wyraźnie widoczne.

Zdjęcie 16. Śledziona, grupa kontrolna, 6 mies, H+E pow. 40x

Zdjęcie 17. Śledziona, stal AISI 316L, 6 mies, H+E pow. 40x

Zdjęcie 18. Śledziona, stal + DLC, 6 mies, H+E, pow. 40x

Na fotografiach śledziony z grupy kontrolnej oraz z implantem z powłoką po 6 miesiącach obserwujemy naczynia krwionośne zabarwione na różowo, co nie było widoczne dla próbek po 24 godzinach. Zdjęcie 17 pokazuje, że mimo długiego czasu gojenia po operacji dla stali, w śledzionie pozostaje reakcja w postaci przekrwienia. Świadczy o tym zbyt duża ilość czerwonych krwinek w tkance. Na kolejnym zdjęciu, na którym są obecne naczynia, nie obserwujemy przekrwienia, lecz prawidłowy przepływ krwi. 5. Wnioski: 



Po 24 godzinach reakcją na implantację stali AISI 316 LVM jest pojawienie się stanu zapalnego. Jest to naturalna reakcja organizmu na proces implantacji. Stan zapalny występuje również po implantacji tej samej stali z powłoką DLC, lecz jest on zauważalnie mniejszy, co świadczy o lepszym i szybszym procesie gojenia, gdy powłoka węglowa jest stosowana. W obu przypadkach widać to zarówno w śledzionie, jak i w tkance około implantacyjnej. Stan zapalny w tkance około implantacyjnej znacznie zmniejsza się po upływie 6 miesięcy od implantacji w przypadku stali bez powłoki. Jednak widoczny jest duży stan zapalny w śledzionie, co może świadczyć o przenikaniu jonów tego implantu do organizmu. Natomiast stal z powłoką węglową charakteryzuje się brakiem stanu zapalnego po upływie 6 miesięcy zarówno w tkance jak i śledzionie, co potwierdza wcześniejszą obserwację, że powłoka węglowa na stali przyspiesza okres regeneracji tkanki. Pokazuje to również, że powłoka DLC zabezpiecza organizm przed przenikaniem jonów z implantu.

 

Tkanka z grupy kontrolnej potrzebna nam jest do tego, by obiektywnie zaobserwować pojawiające się zmiany na skutek implantacji. Im bardziej intensywne zabarwienie na niebiesko w przypadku metody Massona tym starsze włókno kolagenowe, a co za tym idzie wcześniejsze wygojenie danego obszaru.

6. Literatura:  



http://histologia.sum.edu.pl/files/Histotechnika1.pdf https://pl.wikipedia.org/wiki/Barwienie_hematoksylin%C4%85_i_eozyn%C4%85 Instrukcja do laboratorium....