Opracowanie notatek z biologii komórki PDF

Preview

Summary

04.10 METODY STOSOWANE W BIOLOGII KOMÓRKI Biologia komórki:  Jest jedną z najszybciej rozwijających i zaawansowanych dziedzin przyrody  Współczesne badania koncentrują się na budowie, funkcji i zależnościami między budową a funkcją  Komórki są podstawowym elementem każdego organizmu  Każda komór...

Description

04.10.2007 METODY STOSOWANE W BIOLOGII KOMÓRKI Biologia komórki:  Jest jedną z najszybciej rozwijających i zaawansowanych dziedzin przyrody  Współczesne badania koncentrują się na budowie, funkcji i zależnościami między budową a funkcją  Komórki są podstawowym elementem każdego organizmu  Każda komórka otoczona jest błoną komórkową  Cechą charakterystyczna komórki jest zdolność do tworzenia własnych kopii  Ważnym wydarzeniem dla biologii komórki było wynalezienie mikroskopu świetlnego w połowie XVII wieku; pozwoliło to odkryć komórkę Przełomowe daty dla biologii komórki: 1655 – Robert Hook użył prymitywnego mikroskopu i jako pierwszy nazwał elementy korka komórkami 1676 - Antonie van Leeuwenhoek przy użyciu mikroskopu odkrył pierwotniaki, a w 1685 odkrył bakterie 1833 - Brown obserwując storczyki opisał dokładnie jądro komórek roślinnych 1838 - Schwann i Schleiden ogłosili Teorię Komórkową - każdy organizm roślinny i zwierzęcy składa się z komórek zawierających jądro komórkowe 1857 – Kölliker opisał mitochondriom w komórkach mięśniowych 1873 - Golgi Camillo opracował metodę barwienia preparatów mikroskopowych solami srebra, dzięki czemu zbadał budowę neuronu 1879 - Flemming opisał zachowanie się chromosomów mitotycznych w komórkach zwierzęcych 1879 – Cayal opracował metody barwienia, które umożliwiły badania nad budową komórki nerwowej 1898 - Golgi opisał poraz pierwszy struktury, które zostały nazwane od jego nazwiska (aparaty Golgi'ego) 1902 - Theodor Boveri odkrył związek chromosomów z dziedzicznością 1952 - Pallad i inni rozwinęli metody mikroskopii elektronowej, pozwoliło to dostrzec budowę cytoszkieletu i ultrastrukturę organelli 1957 - Robertson korzystając z mikroskopii elektronowej wykazał dwuwarstwowy charakter błony komórkowej STOSOWANE METODY BADAWCZE W BIOLOGII KOMÓRKI: Badania mikroskopowe:  obserwacje mikroskopowe umożliwiają zapoznanie się z budową i funkcją oraz analizą procesów zachodzących w komórkach  oglądać można komórki, organelle i cząsteczki  przeciętna średnica komórek wynosi od 5 do 20 mikrometrów Mikroskop świetlny:  pozwala na powiększenie do 1000x i jest podstawowym narzędziem badawczym w biologii komórki  zdolność rozdzielcza 0,2 mikrometrów

1

 zdolności rozdzielcza - najmniejsza odległość między dwoma dostrzegalnymi punktami  aby oglądać komórki w mikroskopie świetlnym potrzeba 3 czynników:  odpowiednio przygotowany preparat (cienki i często wybarwiony)  padające światło skupione przy pomocy soczewek w kondensatorze  aby ogniskować obraz w oku potrzeba systemu dobrze ustawionych soczewek Odmiany mikroskopu świetlnego:  kontrastowo-fazowy  kontrastuje struktury, które w normalnych mikroskopach są przejrzyste i słabo widoczne  pozwala na przekształcenie przesunięć fali świetlnej,  zmiany jej amplitudy są lepiej widoczne przez oko ludzkie (nie ma różnicy między nimi) - pozwala to na przesunięcie amplitudy fali świetlnej, a obiekty stają się niewidoczne  interferencyjny  stwarza podobne możliwości – korzysta z interferencji (nakładania) - nakłada wiązki świetlne na siebie  nie jest konieczne barwienie  układ optyczny morawskiego – powszechnie stosowany do obserwacji nie barwionych komórek;  fluorescencyjny  pozwala na uzyskanie informacji cytochemicznej, dzięki zastosowaniu UV jako źródła światła, który wywołuje fluorescencję niektórych substancji chemicznych  fluorescencja o pierwotna/naturalna (chlorofil świeci na czerwono; kutyna na żółtozielono; lignina na żółto-pomarańczowo-zielono) o wtórna (występuje w przypadku stosowania fluorochromów specjalnych barwników fluoryzujących; oranż akrydyny łączy się z DNA i powoduje świecenie się na zielono, RNA na czerwono, błękit alininowy wykazuje żółtą fluorescencję kalozy)  konfokalny/współogniskowy  inne źródło światła - laser o zakresie fal bliskich UV  skanuje badany preparat, co pozwala wyeliminować warstwy znajdujące się powyżej i poniżej podmiotu badanego  skanowany obraz jest zapisywany i wyświetlany na ekranie monitora trójwymiarowej rekonstrukcji komórki Mikroskopy elektronowe:  do tworzenie obrazu wykorzystuje się strumień elektronów o niewielkiej długości fali  umożliwia to milionkrotne powiększenie, przy rozdzielczości tysiąckrotnie mniejszej niż w optycznym - 2nm  umożliwia wgląd do organelli, a także pojedynczych cząstek  ogólna budowa podobna do mikroskopu świetlnego:  działo elektronowe wytwarza strumień elektronów, przyspieszany w polu elektromagnetycznym, naginany przez soczewki (wszystko w komorze próżniowej)

2

 W badaniach komórek wyróżniamy dwa typy mikroskopu elektronowego:  transmisyjny mikroskop elektronowy (TME) o podobna zasada jak w mikroskopie świetlnym o przez preparat skontrastowany solami metali ciężkich przechodzi strumień elektronów o obraz jest rzutowany na ekran, który jest pokryty warstwą substancji fluoryzującej o pod wpływem bombardowania powstaje monochromatyczny obraz utworzony przez jasne i ciemne kontury o rozdzielczość - 2nm;  scanningowy mikroskop elektronowy (SME) o tworzy wyraziste obrazy trójwymiarowe o dużej (3-20nm) rozdzielczości; o strumień elektronów skanuje powierzchnie preparatu pokrytą przez warstwę złota lub platyny o elektrony są odbijane i wychwytywane przez detektor umieszczony po wyżej preparatu, ten przekształca je w impulsy elektryczne o trudne i pracochłonne przygotowanie preparatu o po zobrazowaniu kształtu małych jednostek stosuje się barwienie negatywowe, substancja wypełnia przestrzenie "pomiędzy"- powstają jasne struktury na ciemnym tle o cieniowanie - cienka warstwa platyny "pod kątem" pozwala na pokazanie różnicy grubości napylanych struktur o metoda mrożenia i łamania - badanie błon biologicznych. zamraża się ciekłym azotem i cieniuje platyną .  Mikroskopia ta pozwala na zapoznanie się z morfologią lecz nie pozwala uzyskać danych cytochemicznych Badania cytochemiczne:  pozwalają na odkrycie in situ konkretnych związków i substancji chemicznych  reakcja PAZ (na wykrycie obojętnych wielocukrów)  reakcja Folgena (wykrywa kwasy nukleinowe)  reakcja FIF (fluorescencja indukowana formaldehydem, wykrywanie amin)  Metody immunocytochemiczne  rozpoznaje białka  wykorzystują wysokie swoistości wiązania się antygenu z przeciwciałem  cząsteczka przeciwciała wiąże i rozpoznaje konkretny antygen poprzez podawanie konkretnych przeciwciał  Metoda hybrydocytochemiczna  wykrywanie DNA i RNA  wykorzystują zjawisko hybrydyzacji kwasów nukleinowych  rozpoznają konkretne sekwencje nukleotydów - odcinki komplementarne łączą się in situ (w miejscu)  odpowiedni kwas musi mieć odpowiednią sekwencję  syntetyzuje się komplementarną strukturę - sondę, następnie znaczy się fluorochromami, antygenami lub izotopami promieniotwórczymi  łączą się (hybrydyzują) i np. świecą - przy fluorochromie  FISH (fluorescent in situ hybridization) - pozwala na zlokalizowanie i identyfikację

3

 pozwalają na zidentyfikowanie obcych kwasów nukleinowych; jeśli jest mało kwasu DNA, należy namnożyć DNA oraz zastosować PCR in situ (techniką reakcji łańcuchowej polimerazy) - następuje powielenie badanego odcinka  Metoda autoradiografii  pozwala na wykrycie izotopów promieniotwórczych  wykorzystując ich zdolność wybarwienie się emulsji światłoczułych stosowanych w fotografii (na czarno)  po wprowadzeniu substancji zawierającej izotopy, można śledzić procesy metaboliczne(znakowanie substancji)  pokrycie gotowego preparatu cienką warstwą substancji światłoczułej  promieniowanie beta powoduje wytrącenie się z azotanu srebra - ziarna srebra, które uwidocznione są na preparacie  na preparacie w miejscu znaczenia występują stronty w miejscach określonych syntez oraz można określić ich aktywność przez ilość strontów  służy do oznaczenia białek i kwasów nukleinowych  Cytometria przepływowa  metoda ta pozwala na ilościową ocenę właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek przepływających przez miejsce pomiaru (tylko komórki w formie zawiesiny - m.in. w formie wyizolowanych jąder

 odczyty z każdego pomiaru są zliczane, rejestrowane i statystycznie analizowane przez komputer  nie należy do technik mikroskopowych, jednak przygotowanie obejmuje metody cytochemiczne i izometryczne  bardzo szerokie zastosowanie w medycynie i weterynarii  można badać kształt, rozmiar i zawartość DNA, ploidalność, obecność gazów, białek, cukrowców, przepuszczalność błon, aktywność błon, wewnętrzne pH komórki oraz stężenie jonów  w praktyce klinicznej służy do diagnostyki chorób krwi, zaawansowania chorób nowotworowych, zaburzeń układu immunologicznego

Badania biochemiczne i molekularne:  mają na celu wyizolowanie z komórek, a następnie scharakteryzowanie określonych substancji chemicznych w szczególności białek i kwasów nukleinowych (ex situ poza komórką)  do rozdziału białek i kwasów nukleinowych służy elektroforeza  metoda ta wykorzystuje zdolność do poruszania się cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym  służy do rozdziału mieszanin białek i kwasów nukleinowych, które różnią się ładunkami, więc i prędkością poruszania się jonów w polu elektrycznym  po pewnym czasie elektroforezy następuje rozdział mieszanin wzdłuż linii pola elektrycznego  każdy ze składników znajduje się w innym miejscu podłoża stałego  w ten sposób, wycinając odpowiedni fragment podłoża stałego można wyizolować skład  Podłoża:

4

 do kwasów nukleinowych – elektroforeza na żelach agarowych (kwasy nukleinowe wcześniej pocięte na krótsze odcinki przy użyciu enzymów restrykcyjnych, działających w odpowiednich miejscach)  do białek – elektroforeza na żelu poliakrylamidowym ( w obecności SDS dodecylosiarczanu sodu)  Największą efektywność w rozdzielaniu białek wykazuje elektroforeza dwukierunkowa (rozdział na dwukierunkowej płaszczyźnie). Pozwala na wyodrębnienie 1000 białek z jednej próbki  Do identyfikacji (sekwencjonowania) rozdzielonych białek i sekwencjonowania kwasów nukleinowych najczęściej służy blotting (odciskanie, plamy na bibule):  suthern blotting (południowy) – wykrywa pojedyncze, krótkie odcinki DNA i RNA, stosowana jest sonda (komplementarna do odcinka kwasu nukleinowego – DNA lub RNA)  northern blotting (północny) - tylko RNA, też przy udziale sond  western blotting (zachodni) - wykrywa białka przy użyciu odpowiednio znakowanych przeciwciał  Rozdzielane podczas elektroforezy substancje przenosi się z żelu na błonę nitrocelulozową lub nylonową (polega na odciśnięciu w obecności roztworu ekstrakcyjnego, z żelu na odpowiednią błonę)  Zachowuje rozmieszczenie rozdzielonych elementów i sekwencjonowanie przy użyciu metody hybrydyzacji przy pomocy sond lub przeciwciał znakowanych enzymami, pierwiastkami promieniotwórczymi (izotopami)  Są bardzo czułe - pozwalają na wykrycie już od 10 pikogramów substancji  PCR (Polymerase Chain Reaction) - umożliwia wykrycie śladowych ilości kwasów nukleinowych, polega na powieleniu cząsteczek kwasów nukleinowych 11.10.2007 BUDOWA I RÓŻNICOWANIE SIĘ KOMÓREK  komórka roślinna i zwierzęca 5-20 mikrometrów  wszystkie komórki powstały w toku ewolucji zjednej prakomórki wyjściowej (ok. 3 mld lat temu); Podział:  Prokaryota:  komórki bez jądra komórkowego  bez organelli  bakterie i sinice (cyjanobakterie)  bardzo małe < 7 mikrometrów  w większości jednokomórkowe, ale zorganizowane w grona, łańcuchy etc  nie posiadają błony, wyodrębnionego jądra ani organelli  występuje gruba ściana komórkowa (15-100 mikrometrów)  ściana komórkowa zbudowana z proteoglikanów; czasem pokryta otoczką śluzową  u bakterii chorobotwórczych ściana komórkowa zbudowana z cząsteczek glikoproteinowych  ściana komórkowa utrzymuje kształt i chroni przed rozerwaniem  właściwa błona pod ścianą jest kompleksem białkowo-lipidowym

5

 tworzy liczne wypustki do wnętrza komórki, prawdopodobnie zwiększając powierzchnię oddechową bakterii  zawiera również liczne receptory białkowe - w ten sposób może dostosować się do warunków środowiska  chromosom jest kolistą dwuniciową cząsteczką DNA  w cytoplazmie znajdują się mRNA, tRNA i rRNA  rybosomy ze stałą sedymentacji 70s (biosynteza białka)  liczne pęcherzyki gazowe, krople lipidów, wielocukry, nieorganiczne fosforany, zorganizowane w postaci ziaren sferycznych  wiele bakterii posiada zdolność ruchu, zbudowane przez rzęski z flagelliny  elementy roślinneto gruba ściana komórkowa  elementy zwierzęce to rzęski zbudowane z flagelliny  cyjanobakterie (sinice) o najprymitywniejsze autotrofy zawierające chlorofil o zamieszkują wszystkie nisze ekologiczne o barwniki : chlorofil, karoten, ksantofil, fitocyjanina i tzw. skrobia sinicowa o są one rozpuszczone w cytoplazmie lub wbudowane w błoniaste struktury (nie posiadają chloroplastów) o bakterie i cyjanobakterie zawierają złożone układy, które umożliwiają im syntezę wszystkich niezbędnych składników o potrafią wiązać N i C o stanowią główną masę biosfery  Eukaryota:  posiadają komórki eukariotyczne z wyodrębnionym jądrem komórkowym oraz organellami  występują zarówno jednokomórkowe (drożdże i pierwotniaki) jak i wielokomórkowe (grzyby, rośliny i zwierzęta)  posiadają: mitochondria, chloroplasty, cytoszkielet, lizosomy, rybosomy, aparat Golgiego  JĄDRO: o największa struktura, położona centralnie o stanowi centrum informacji genetycznej o chromatyna w chromosomach  MITOCHONDRIA: o podwójna błona o owalne o posiadają własne DNA o potrafią się dzielić o magazynowana energia w postaci wysokoenergetycznych wiazań ATP  CHLOROPLASTY: o występują u roślin o podwójna błona o własne DNA o chlorofil potrzebny do fotosyntezy  BŁONY: o siateczka śródplazmatyczna - gładka lub szorstka  LIZOSOMY : o System GERLL

6

o Enzymy proteolityczne, tworzące wewnątrzkomórkowe  PEROKSYSOMY: o Środowisko do rozkładu nadtlenku wodoru  CYTOZOL: o wewnątrzkomórkowa przestrzeń o wodny żel, w którym przebiegają reakcje chemiczne (synteza białek, rozkład cząsteczek pokarmowych)  CYTOSZKIELET: o system włókien - system włókien: filamenty i mikrotubule, które rozciągają się przez całą komórkę o decyduje o wewnętrznej organizacji komórki o niezbędny w komórkach zwierzęcych i roślinnych o system rurek i beleczek nadaje odporność mechaniczną o umożliwia ruch o warunkuje kształt o bierze udział w podziałach komórkowych – organizacja wrzeciona kariotycznego i cytokinetycznego Jedność i różnorodność komórek: Różnice:  wszystkie komórki różnią się rozmiarem i kształtem  bakteria bdellowibria ma kształt torpedy, która porusza się do przodu przez owiniętą wić  komórki:  zwierzęce - błona komórkowa  roślinne - ściana komórkowa  tkanki kostne - otoczone twardą zmineralizowaną substancją  również funkcje różnią komórki  tkanka każdego narządu pełni inne funkcje  komórki różnią się aktywnością  niektóre pobierają tlen, dla innych jest on letalny  produkują hormony, enzymy, skrobie, tłuszcz i barwniki  kształt, wielkość, funkcje i wymagania różnią komórki  wszystkie komórki podobne pod względem biochemicznym, mają podobną ultrastrukturę Podobieństwa:  wszystkie składają się z genów zapisanych trójkowym kodem chemicznym  replikują - synteza białek taka sama w każdej komórce  białka składają się z takich samych (23) aminokwasów, które połączone są w różnych sekwencjach  Prakomórka powstała 3-3,8 mld lat temu - ulegała ewolucji na skutek mutacji ORGANIZMY MODELOWE (RÓŻNICOWANIE OD KOMÓREK PROKARIOTYCZNYCH DO EUKARIOTYCZNYCH) BAKTERIE:  najmniejsze i najprostsze prokatyota  zróżnicowany kształt (kulisty, pałeczkowaty, śrubowaty)  długość kilka mikrometrów  gruba ściana komórkowa  błona komórkowa

7

 w centrum pojedyncza lub podwójna cząsteczka DNA  w mikroskopie elektronowym wnętrze nie zawiera zorganizowanej struktury i organelli komórkowych  rozmnażają się przez podział z częstotliwością co 20 min, także jedna bakteria może w ciągu 11 h wytworzyć 15 mld komórek  stąd też mogą szybko ewoluować, zdobywać nowe źródła pokarmu  zdobywają odporność na antybiotyki  wykorzystują ogromną rozpiętość środowiska - od wulkanów do wnętrza innych komórek  niektóre fotosyntetyzują, inne chemosyntetyzują  pod względem ilościowym przewyższają inne organizmy  modelowa bakteria - Escherichia coli – żyje w jelicie cienkim, posiada 4000 białek z DNA; pierwsze eksperymenty na kwasach nukleinowych; replikacja i odczytywanie przebiega jak u wyżej zorganizowanych organizmów GIARDIA:  prymitywny eukaryota  pośredni etap w ewolucji  jednokomórkowy organizm pasożytniczy  posiada dwa wyodrębnione identyczne jądra  nie posiada organelli ani struktur - poza cytoszkieletem  pasożytuje w warunkach beztlenowych w jelicie cienkim DROŻDZE PIEKARSKIE:  typowe komórki eukariotyczne  małe jednokomórkowe grzyby  otoczone grubą ścianą komórkową (cecha charakterystyczna dla świata roślin)  zawierają mitochondriom  nie posiadają chloroplastów  rozmnażanie przez podział tak szybko jak bakterie PIERWOTNIAKI:  jednokomórkowe, ale w wielu formach duże i złożone  bardzo agresywne  ruchliwe bądź osiadłe  mięsożerne lub fotosyntetyzujące  posiadają wyrostki czuciowe, fotoreceptory, rzęski, aparaty gębowe, wiązki kurczliwe podobne do mięśni DIDINUM:  bardzo podobna budowa do organizmów wielokierunkowych  duży  mięsożerny  do 150 mikrometrów  kulisty kształt  otoczony dwoma pasmami rzęsek  uwypuklenie podobne do ryjka  szybko pływa i odżywia się innymi pierwotniakami wyrzucając z ryjka paraliżujące strzałki

8

OEGANIZMY WIELOKIERUNKOWE:  grzyby  rośliny  zwierzęta  Arabidopsis thaliana – rzodkiewnik pospolity – modelowa roślina spośród 300000 roślin  niewiele DNA 3-4 razy więcej niż u drożdży  z tej uwagi jest rośliną modelową w badaniach genetycznych i biochemicznyc  Zwierzęta:  muszka owocowa, nicień, mysz  spośród wielokomórkowych, większość stanowią owady (Drosophila melanogaster)  modelowy nicień (Caenorhabditis elegans) o jest mniejszy i prostszy niż Drosophila melanogaster o dokładnie poznano już rozwój od zapłodnionej komórki jajowej do dojrzałej postaci o składa się z 959 komórek u dojrzałego osobnika  Homo sapiens o badane jedynie w hodowlach komórek z powodów etycznych o dokładnie poznane mutacje w tysiącach genów o znana kolejność nukleotydów i liczbą genów, ale nie znane dokładne funkcjonowanie o duże zróżnicowanie komórek w tkanki, te z kolei zorganizowane w narządy o komórki różnych tkanek są bardzo niepodobne (np. tłuszczowa i kostna) o powstają w rozwoju embrionalnym z jednej zapłodnionej komórki jajowej o wszystkie mają jednakowe DNA o różnicują się poprzez różne wykorzystywanie sekwencji o nie wszystkie geny są wykorzystywane we wszystkich komórkach o różna ekspresja genów w różnych komórkach o posiadają identyczne instrukcje genetyczne, ale w różny sposób wykorzystywane, dlatego są tak zróżnicowane (nie całe DNA jest wykorzystywane) 18.10.2007 BŁONY KOMÓRKOWE     

Podstawowy składnik każdej komórki Stanowią barierę oddzielającą zawartość komórki od środowiska i od siebie Umożliwiają wzrost i zmianę kształtu Selektywne bariery między przestrzeniami Bakterię mają pojedynczą błonę (oprócz błony, otoczone są cytolemmą, ale zawierają stosunkowo dużo błon wewnętrznych – 95% - 98% wszystkich błon)

Wyróżniamy:  Błonę jądrową (nukleolemmę)

9

    

Błonę siateczki śródplazmatycznej (retikulum) Błonę układu Golgi’ego Błony lizosomalne Błony mitochondrialne Błony innych wewnątrzkomórkowych elementów obłonionych

Budowa:  Wszystkie błony zbudowane są podobnie  Białka błonowe nadają charakter błonom Skład:  Składają się z dwóch podstawowych elementów: białek i lipidów  Niektóre posiadają jeszcze elementy węglowodanowe Wspólny plan budowy – modele:  Płynna mozaikowa budowa błon, zakłada że składają się z podwójnej warstwy lipidowej, w której zanurzone są cząsteczki białka  Podwójna błona, zbudowana z hydrofilowych cząsteczek znajdujących się na zewnątrz oraz z nierozpuszczalnych hydrofobowych cząsteczek znajdujących się wewnątrz  Lipidy błonowe są amfipatyczne – mają hydrofilowe i hydrofobowe właściwości  Posiada zdolność do tworzenia dwucząsteczkowej warstwy, w odpowiednich warunkach liposomów – kulistych twórów

Właściwości:  Względna ciągłość (posiada tylko warstwa lipidowa) – cząsteczki warstwy lipidowej mogą się rozsu...