Fluorescencja - opracowanie z seminariów i ćwiczeń PDF

Preview

Summary

Na podstawie książek "Biofizyka. Podręcznik dla studentów" pod redakcją dr Jaroszyka oraz "Wybrane ćwiczenia laboratoryjne z biofizyki" pod redakcją Piskunowicza i Tuliszki...

Description

FLUORESCENCJA Wzbudzenie atomów i molekuł, schemat Jabłońskiego, przejścia energetyczne Poziomy energii elektronowej: ● S - singletowe; wypadkowy spin wszystkich elektronów w cząsteczce =0 (wszystkie elektrony mają sparowane spiny) ● T - tripletowe; wypadkowy spin wszystkich elektronów w cząsteczce=1 (jedna para elektronów ma spiny zgodnie skierowane) Nie wszystkie cząsteczki mają poziomy tripletowe energii elektronowej

Zjawiska możliwe po przejściu elektronu S0->S1: 1) Dezaktywacja bezpromienista cząsteczki - pozbycie się nadmiaru energii oscylacyjnej na drodze bezpromienistej; zmiana stanu energetycznej atomu bez emisji promieniowania 2) Fluorescencja - emisja fotonu o energii mniejszej lub równej energii fotonu zaabsorbowanego Fluorescencja rezonansowa - emisja fotonu o energii = energii zaabsorbowanego fotonu 3) Izoenergetyczne przejście bezpromieniste międzysystemowe ISC - wymuszone przejście S1->T1; w cząsteczkach mających poziomy tripletowe energii elektronowej; zmiana zwrotu spinu jednego z elektronów Potem przejście do S0: ● fosforescencja - związane z emisją fotonu ● przez bezpromieniste przekazanie energii Chromofor - fragment zw. chemicznego (atom/jon/cząsteczka) w obrębie którego zachodzą przejścia elektronowe odpowiedzialne za pasmo widmowe

Widmo absorpcyjne - widmo powstające podczas przechodzenia promieniowania magnetycznego przez ośrodek absorbujący promieniowanie o określonej długości fali; Cząsteczka ma określone widmo absorpcyjne -> absorbuje fotony o określonych energiach, odzwierciedlających układ ich poziomów energetycznych (zależnych od struktury cząsteczki); Zależność ilości zaabsorbowanej energii promieniowania elektromagnetycznego przez ośrodek od długości fali tego promieniowania Widmo emisyjne = widmo spektroskopowe - obraz promieniowania elektromagnetycznego wysyłanego przez strukturę Widmo fluorescencji jest lustrzanym odbiciem widma absorpcyjnego - przesunięte w stronę fal dłuższych - bardziej strome w stronę fal krótkich Fotoluminescencja = dezaktywacja promienista stanów wzbudzonych - emisja promieniowania elektromagnetycznego przez atomy/cząsteczki, w wyniku pochłonięcia przez nie energii świetlnej ● fluorescencja - zjawisko emitowania fotonów przez wzbudzone atomy/cząsteczki, związane z przejściem elektronu z poziomu energii S1 do S0 ● fosforescencja - zjawisko emitowania fotonów przez wzbudzone cząsteczki/atomy, będące następstwem przejścia elektronu z poziomu energetycznego T1 do S0 Autofluorescencja - naturalna emisja światła przez struktury biologiczne w wyniku zaabsorbowania przez nie światła, używana do odróżnienia światła które pochodzi ze sztucznie dodanych fluorochromów Autofluorescencyjne molekuły: - NADH - tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina (a więc niektóre białka) - flawiny Wzbudzenie dwufotonowe - prawie jednoczesna absorpcja dwóch fotonów o niższej energii wywołująca sumaryczny efekt porównywalny do absorpcji jednego fotonu o większej energii; Laser używany w mikroskopie dwufotonowym emituje niskoenergetyczne fale z zakresu ok. 700-1000 nm Rezonansowe przekazywanie energii (rezonansowy transfer energii - FRET) mechanizm przenoszenia energii między dwoma chromoforami na drodze innej niż promieniowanie; Transfer fluorescencyjny - jeżeli donor i akceptor to fluorofory

Odległość donora i akceptora - do 10 nm ● gdy odległość donor-akceptor 10nm: emisja fali przez donor z charakterystycznym dla niego maksimum emisji Zastosowanie: Badanie interakcji i odległości między molekułami wyznakowanymi fluorescencyjnie ● zadziałanie na mieszaninę wyznakowanych białek światłem o długości fali równej max. absorpcji donora ● rejestracja widma emisyjnego: jeżeli emitowana fala ma dł. odpowiednią maksimum emisji akceptora → odległość molekuł mniejsza lub równa 10 nm → między molekułami może zachodzić interakcja Metody ilościowego pomiaru fluorescencji Zazwyczaj stosuje się metodę krzywej wzorcowej - zależność intensywności fluorescencji od stężenia związku fluorescencyjnego w próbce; Mierzenie ilości energii promieniowania pochłoniętego przez daną probówkę IF = lo * k * c * l IF - intensywność fluorescencji k - współczynnik fluorescencji l - grubość warstwy roztworu Intensywność fluorescencji zwiększa się liniowo do pewnego stężenia, potem następuje gaszenie stężeniowe fluorescencji Natężenie fluorescencji zależy od: ● pH ● temperatury (im wyższa tym mniejsza int.) ● obecności wygaszaczy Wygaszanie fluorescencji- dezaktywacja stanów wzbudzonych cząteczek fluoroforów na drodze bezpromienistego przekazywania energii cząsteczkom innej substancji (wygaszacza) Mechanizm wygaszania zależy od struktury użytego wygaszacza: ● statyczne - wygaszenie fluorescencji jeszcze przed rozpoczęciem emisji światła ● dynamiczne = kolizyjne - zachodzi już po rozpoczęciu emisji światła W roztworach rozcieńczonych o określonym stężeniu wygaszacza ustala się równowaga między szybkością powstawania cząsteczek wzbudzonych a szybkością ich dezaktywacji.

Przykładowe wygaszacze: - tlen cząsteczkowy - akrylamid - jon jodkowy Wykorzystanie wygaszania: spektroskopia fluorescencyjna -> badanie struktury i dynamiki białek Czas życia fluorescencji Średni czas jaki cząsteczka przebywa w stanie wzbudzonym, charakterystyczny dla danego fluorochromu; Czas po którym początkowe natężenie fluorescencji wzbudzonej cząsteczki maleje e razy Zależy od zmian właściwości fizykochemicznych w otoczeniu cząsteczki fluorochromu → badanie procesów w komórkach Nie zależy od natężenia użytego światła ani stężenia fluorochromu Opóźnienie emisji fluorescencyjnej - czas od naświetlenia fluoroforu do emisji światła ● we fluorescencji -> ok. 10^-8 s = czas przebywania cząsteczki w stanie S1 po przejściu ze stanu S0 ● w fosforescencji -> do kilku sekund Właściwości wybranych białek stosowanych jako markery fluorescencyjne GFP - białko zielonej fluorescencji ● może być syntezowane w komórkach organizmu badanego ● trwałe (pozwala na dokładne pomiary - niewielka szansa błędu wynikającego ze zniszczenia białka) ● może być dziedziczone Istnieje wiele wariantów GFP (green fluorescent protein) które można wprowadzać do komórek gospodarza na drodze inżynierii genetycznej, jednak samo znakowanie białek wymaga - oczyszczania - modyfikacji chemicznych białek - iniekcji do komórki...