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Chapitre 6 : Spectroscopie et Spectrophotométrie

I – Transmittance, absorbance et loi de Beer-Lambert A- Transmittance et absorbance 1. Rayonnement incident On considère un rayonnement lumineux d’intensité initiale I0 et de longueur d’onde λ. Ce rayonnement a pour énergie E = hν = hc/λ, où ν est la fréquence de l’onde, c la vitesse de la lumière dans le vide et h la constante de Planck. En spectroscopie on utilise en plus le nombre d’onde ν+, donné en cm-1 , défini par : Le rayonnement lumineux traverse un échantillon de matière (= le milieu) donc une partie de l’onde est absorbée. L’intensité transmise I à la sortie du milieu est proportionnelle à l’intensité initiale I0.

2. Transmittance On définit la transmittance T à la longueur d’onde λ comm

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Pour un milieu donné, d’épaisseur traversée fixée, avec une longueur d’onde fixée pour l’OEM, la transmittance est une constante. T est sans unité ; elle est généralement exprimée en %. Mais T (et donc I) varient avec l’épaisseur L du milieu traversé, et en résolvant l’équation

différentielle associée à I on trouve : dans laquelle a est une constante (le coefficient d’absorption). 3. Absorbance On définit aussi l’absorbance A à la longueur d’onde λ, qui mesure la capacité d’un milieu à absorber la lumière qui le traverse. On l’appelle également densité optique (DO). A est sans unité et vaut :

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Définition : L’absorbance est le rapport entre l’intensité lumineuse initiale I0, avant la traversée du milieu, et l’intensité lumineuse transmise I, exprimée en logarithme décimal. L’absorbance A diffère selon la nature du milieu traversé et selon la longueur d’onde à laquelle ce milieu est étudié.

On peut écrire l’absorbance A en fonction de l’épaisseur L ( cm) du milieu traversé et de son coefficient d’absorption a ( cm-1) : Le coefficient d’absorption a dans cette formule est proportionnel : - au nombre de molécules absorbantes du milieu traversé par unité de volume. Pour une solution, on utilise la concentration C en molécules absorbantes, en g.l-1 ou en mg.ml-1. - à un coefficient propre au milieu, donc à la molécule absorbante, qui dépend de la longueur d’onde de l’OEM. On utilise ε, appelé coefficient d’extinction moléculaire et exprimé en l.g1 .cm-1 ou en ml.mg-1.cm-1 suivant l’unité utilisée pour la concentration C.

B- Loi de Beer-Lambert On en déduit la loi de Beer-Lambert : C = concentration C en molécules absorbantes, en g.l-1 ou en mg.ml-1. ελ = coefficient d’extinction (moléculaire), en l.g-1.cm-1 ou en ml.mg-1.cm-1 suivant l’unité utilisée pour C. L = épaisseur du milieu absorbant traversé, en cm. La mesure de l’absorbance se fait grâce à un spectrophotomètre (on parle de spectroscopie, spectrométrie ou spectrophotométrie). L’appareil est étalonné sur la longueur d’onde d’absorption du milieu à étudier. L’étalonnage consiste à établir expérimentalement la courbe donnant l’absorbance A en fonction de la concentration C, en effectuant des mesures de A pour différentes concentrations. On reporte ensuite la mesure d’absorbance associée à la concentration inconnue sur la courbe et on lit directement la valeur de C. Plus le milieu est concentré en molécules absorbantes, plus il absorbe de la lumière (avec l’absorbance donnée par la loi de Beer-Lambert). La loi de Beer-Lambert permet donc de déterminer la concentration inconnue d’un ou plusieurs éléments dans une solution absorbante donnée.

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Si on considère plusieurs éléments i, ayant chacun un coefficient d’extinction εiλ et une concentration Ci , l’absorbance s’écrit :

On peut par exemple suivre l’évolution d’une population bactérienne dans une culture en mesurant l’absorbance du milieu de culture grâce à un spectrophotomètre. Si le milieu n’absorbe pas assez la lumière pour effectuer des mesures correctes en spectrophotométrie, on le fait réagir avec un autre élément pour que le produit de la réaction affiche une couleur bien visible. L’intensité de la coloration obtenue est proportionnelle à la concentration réelle. C’est le principe de la colorimétrie.

II – La spectroscopie ou spectrophotométrie Les phénomènes d’émission et d’absorption d’ondes électromagnétiques par un milieu constitué de molécules, dépendent du spectre en énergie des molécules, qui a des niveaux d’énergie quantifiés (seules certaines valeurs fixées de l’énergie sont possibles pour cette molécule). Pour simplifier on considère les mouvements internes de molécules diatomiques. L’énergie totale interne Eint d’une molécule diatomique peut être considérée comme constituée de : • l’énergie électronique El : énergie potentielle d’interaction des couches électroniques, dont le minimum correspond à la position d’équilibre stable de la molécule ; • l’énergie de vibration Evib : les atomes peuvent vibrer autour de la position d’équilibre stable de la molécule ; • l’énergie de rotation Erot : la molécule diatomique peut être considérée comme un ensemble rigide (une haltère) qui peut tourner autour d’axes perpendiculaires à cette ligne formée par la molécule. On peut donc écrire l’énergie interne de la molécule comme : Du fait de la quantification de l’énergie, Eint ne va prendre que certaines valeurs. Les niveaux d’énergie électronique d’un atome à Z électrons gravitant autour d’un noyau sont complètement déterminés grâce à l’ensemble de ses nombres quantiques (connus). Les niveaux d’énergie de vibration d’une molécule diatomique ont un espacement constant, égal à hν, où ν est la fréquence de la vibration. Les niveaux d’énergie de rotation sont espacés de ΔEJ = EJ+1-EJ , qui n’est pas une constante mais varie comme J+1, avec J = 0, 1, 2,… qui est le nombre quantique associé à la rotation. → On peut donc déterminer complètement le spectre en énergie d’une molécule dès qu’on connaît ses niveaux de vibration et de rotation. Page 3 sur 6

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A- Émission et absorption d’une onde électromagnétique On considère un photon, de longueur d’onde λ et de fréquence ν. L’émission ou l’absorption de ce photon, quelle que soit λ, s’accompagne pour le milieu qui émet ou absorbe le photon, d’une transition entre deux niveaux d’énergie : l’état initial et l’état final (par principe de conservation de l’énergie).

Ces niveaux sont caractéristiques du spectre des atomes (ou molécules) du milieu. Ce sont des niveaux électroniques, de rotation ou de vibration. A partir d’un niveau initial, on ne va pas atteindre tous les niveaux finaux : il existe des règles de sélection. 1. Absorption Supposons qu’un atome (ou une molécule) possède deux niveaux d’énergie possibles E1 et E2 (avec E2 > E1). Supposons aussi que l’atome est initialement dans l’état d’énergie E1 avec un électron sur ce niveau E1.. Si on envoie sur cet atome une onde (un photon par exemple) de fréquence ν telle que hν = E2 – E1, l’atome peut absorber l’onde, provoquant un saut de l’électron vers le niveau d’énergie E2.

Il y a donc absorption de lumière, avec une absorbance donnée par la loi de Beer-Lambert. Si on dispose une source de lumière blanche devant un prisme, et qu’on interpose entre la source et le prisme un liquide ou un gaz absorbant, il y a dispersion de la lumière. On observe en sortie du prisme un spectre qui présente des raies ou des bandes noires, correspondant aux raies ou aux bandes absorbées. C’est un spectre d’absorption caractéristique du milieu absorbant traversé. 2. Émission spontanée Page 4 sur 6

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Supposons qu’un atome (ou une molécule) possédant deux niveaux d’énergie possibles E1 et E2 (avec E2 > E1) ait été porté, à l’aide d’une décharge électrique ou par chauffage, dans l’état d’énergie E2. On se retrouve avec par exemple un électron sur le niveau d’énergie E2. L’atome ou la molécule est donc dans un état excité. La désexcitation se produit par un saut de l’électron vers le niveau d’énergie E1, accompagné de l’émission spontanée d’un photon de fréquence hν = E2 – E1.

Si on remplace la source de lumière blanche utilisée en absorption par une lampe à vapeur de sodium ou une lampe à vapeur de mercure par exemple, et qu’on envoie ceQe lumière sur un prisme, on constate en sortie, toujours grâce au phénomène de dispersion de la lumière, un spectre qui présente une série de raies plus ou moins fines, séparées par des plages noires : c’est un spectre de raies d’émission. 3. Fluorescence et phosphorescence Lorsqu’un photon de grande énergie est absorbé par un atome, il y a parfois réémission de lumière. Pour des périodes de désexcitation de l’ordre de 10-9 s, on parle de fluorescence. Si la désexcitation a une période de l’ordre de la seconde, on parle de phosphorescence. Certaines protéines, exposées à de la lumière UV, peuvent être identifiées par leur fluorescence verte.

4. Domaines spectraux La fréquence émise ou absorbée par un atome ou une molécule dépend de la différence d’énergie séparant le niveau initial du niveau final de la transition. Le domaine spectral dans lequel ceQe fréquence sera située dépend donc de l’écart en énergie des niveaux du spectre de l’atome. On peut très schématiquement situer les domaines spectraux correspondant aux différentes transitions possibles. Pour les atomes, les transitions correspondent toujours à des changements d’états électroniques et sont situées dans le domaine visible ou ultra-violet (V-UV). Pour les molécules, les transitions peuvent avoir lieu : • soit entre niveaux d’énergie électroniques : domaine visible ou ultra-violet (V-UV) ; Page 5 sur 6

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• •

soit entre niveaux d’énergie de vibration : domaine infra-rouge (IR) ; soit entre niveaux d’énergie de rotation : IR lointain et micro-ondes.

Les transitions d’énergie sont très différentes dans les trois domaines. En effet, la différence d’énergie entre deux niveaux de rotation successifs correspond à 1/40 de celle entre deux niveaux de vibration et à 1/1000 de celle entre deux niveaux électroniques moléculaires.

B- Spectroscopie et identification de molécules 1. . Domaine du visible et de l’ultra-violet (UV) Ce domaine correspond aux ondes électromagnétiques de longueurs d’onde entre 800 et 80 nm. Le visible va de 800 nm (rouge) à 400 nm (bleu), l’UV proche de 400 à 200 nm, et l’UV lointain de 200 à 80 nm. Ce domaine est très bien connu car étudié depuis longtemps. Il reste indispensable pour une approche expérimentale de la nature de la liaison, mais il est pauvre en information structurale. Son emploi est de plus en plus réservé à une analyse quantitative via la loi de Beer-Lambert. 2. Spectroscopie infrarouge (IR) La spectroscopie infrarouge (IR) s'utilise principalement pour l’analyse qualitative d'une molécule. Elle permet de mettre en évidence la présence d'une liaison vibrationnelle particulière. La région du spectre IR s'étend de 0,75 à 300 mm, mais la majorité des applications se situe entre 2,5 et 15 mm (nombre d'onde entre 4000 cm-1 et 670 cm-1). Le nombre d'onde ν+ est l’unité la plus couramment utilisée en spectro IR car directement proportionnelle à la fréquence (donc à l’énergie) du rayonnement absorbé. Dans les molécules organiques, les atomes sont liés entre eux par des énergies de liaison caractéristiques, correspondant chacune à un type de liaison. Un faisceau IR passe à travers l'échantillon pour exciter les molécules. Les OEM reçues par les molécules provoquent des mouvements entre les atomes et des vibrations dans les molécules : il y a donc absorption d’une partie de l'énergie du rayonnement reçue et on obtient des bandes d’absorption caractéristiques des liaisons chimiques. Réaliser une spectroscopie IR d’une substance absorbante permet donc d’identifier la molécule concernée à partir des bandes d’absorption présentes sur son spectre d’absorption. Si on fait défiler les longueurs d'ondes, on obtient le spectre complet de toutes les vibrations du produit analysé.

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