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Manual de Prácticas de Biología Celular Práctica No. 1 Uso de micropipetas OBJETIVOS 1. El alumno conocerá el uso y manejo adecuado de las micropipetas. 2. Analizará posibles errores en la medición de líquidos. 3. Aplicará el método gravimétrico para verificar la calibración de las micropipetas. 4. El alumno conocerá los términos precisión y exactitud. INTRODUCCIÓN Durante el desarrollo de diversas técnicas y protocolos en biología experimental como en muchas áreas, es necesario utilizar volúmenes pequeños de diversas soluciones. Para poder manejar estos volúmenes, se utilizan micropipetas de diferentes capacidades, dentro de las más comunes se encuentran micropipetas de volumen variable de: 0.5-10 µL, 2-20 µL, 10-100 µL, 20-200 µL y 100-1000 µL o de volumen fijo: 10, 20, 50, 100, 200 y 1000 µL. Las de volumen mayor a 1 mL corresponden a las macropipetas. Existen micropipetas monocanal (una sola punta) y las de múltiples canales (multicanal) con posibilidad de 8 o 12 puntas con volúmenes variables de 20 a 200 o hasta 300 µL. En base a su funcionamiento, existen micropipetas por desplazamiento aire, las cuales sirven para el manejo de líquidos de baja densidad o viscosidad y las de desplazamiento positivo las cuales son útiles para líquidos viscosos o volátiles. Las micropipetas pueden ser mecánicas o automáticas. La unidad de medida de volumen es el litro (L), en las técnicas de biología experimental las unidades más usadas son el microlitro (µL) y el mililitro (mL). 1 litro = 1000 mL 1

1 mL = 1000 µL EQUIPO Y MATERIALES Micropipetas de volumen fijo de 10, 200 y 1000 µL Micropipetas de volumen variable: 0.5-10, 20-200 y 100-1000 µL Microtubos cónicos de 1.8 ML Viales de vidrio de 2 ML de capacidad Puntas adecuadas para las diferentes micropipetas Balanza analítica Centrífuga para microtubos Agua destilada Soluciones de color rojo y azul Aspectos importantes acerca del uso de micropipetas: 1. Verifica que hayas seleccionado la micropipeta correcta para el volumen que necesitas utilizar. El laboratorio cuenta con las siguientes micropipetas de volumen variable de 0.5 a 10 µL, 2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 100 a 1000 µL. 2. Ajusta la micropipeta al volumen deseado. Si la micropipeta cuenta con sistema de seguridad para ajuste de volumen, deberás quitarlo antes de utilizarla. 3. Selecciona y pon la punta correcta en la micropipeta. Verifica que la punta esté correctamente colocada en el extremo de la micropipeta. (No todas las puntas son compatibles con las diferentes marcas de micropipetas). 4. Mantén en posición vertical la micropipeta cuando estés pipeteando la solución de trabajo. (ángulos mayores a 20 grados pueden aspirar hasta 0.7% más del volumen exacto) 5. Respeta el rango especificado en la micropipeta. No trates de usar un volumen fuera ese rango. 6.

Presiona suavemente el émbolo para verter y aspirar los líquidos. Ritmos muy rápidos pueden provocar salpicaduras, aerosoles y entrada de aire, por lo que el volumen aspirado no será exacto.

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7. Es importante hacer un pre enjuague de la punta, ya que los líquidos normalmente dejan una película en la superficie de la punta lo que provoca que la primera medición del líquido sea ligeramente menor que las subsiguientes mediciones. Enjuagar 2 o 2 veces la punta con el líquido. Para aspirar el volumen deseado de la solución de trabajo: 1. Primeramente, debes abrir el contenedor de la solución (microtubo, tubo, frasco, etc.). 2. Sujeta la micropipeta con una mano en posición vertical, mantén el tubo con la otra mano. Realiza este procedimiento a la altura de tu vista. 3. Presiona SUAVEMENTE y mantén el émbolo de la micropipeta al nivel del primer tope. Sumerge la punta (2 - 3 mm) en la solución de trabajo. 4. Aspira el volumen de la solución LENTA Y UNIFORMEMENTE. NO LIBERES DE UN SOLO GOLPE EL ÉMBOLO DE LA MICROPIPETA. Para verter el volumen aspirado de la solución a un contenedor: 1. Abre el contenedor donde colocarás la solución aspirada. 2. Sujeta la micropipeta con una mano en posición vertical, mantén el tubo con la otra mano. Realiza este procedimiento a la altura de tu vista. 3. La punta de la micropipeta deberá tocar la pared del tubo donde colocarás la solución. 4. Presiona SUAVEMENTE y mantén el émbolo de la micropipeta al nivel del segundo tope. Asegura que todo el líquido haya salido de la punta. 5. Manteniendo el émbolo presionado, retira lentamente la micropipeta del tubo y verifica NO succionar nada de la solución que vertiste al tubo. 6. Si necesitas manejar otra solución de trabajo con la micropipeta debes de cambiar la punta y realizar el mismo procedimiento previamente descrito. 7. Para quitar la punta de la micropipeta, debes presionar el botón expulsor de la misma. Dependiendo de la marca y modelo de la micropipeta será el mecanismo expulsor de puntas. PROCEDIMIENTO Técnica de pipeteo 3

El maestro proporcionará 3 soluciones de trabajo: Azul (A), Roja (B) e Incolora (C) 1. Rotula

2 microtubos con los números 1 y 2 para cada una de las

micropipetas a utilizar 2. Adiciona los volúmenes de las soluciones A, B y C especificados en la tabla 1 a cada uno de los tubos Tabla 1. Esquema para preparación de las muestras Micropipeta

0.5-10 µL Tubo 1

20-200 µL Tubo 2

100-1000 µL

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 1 Tubo 2

Solución

volumen en µL para cada microtubo

A

3

2

30

20

300

200

B

5

4

50

40

500

400

C

2

3

20

30

200

300

3. Una vez concluidos estos procedimientos, centrifuga los microtubos a 500xg por 3 min. a temperatura ambiente. 4. Mide el volumen de cada uno de los tubos y regístralo en la tabla 2 de resultados. Reproducibilidad Utilizando tres micropipetas de volumen fijo, realiza lo siguiente: 1. Adiciona 10, 200 y 1000 µL de agua destilada con las micropipetas correspondientes y viértelos en un contenedor previamente tarado, determina el peso de esos volúmenes y regístralo. 2. Repite el mismo procedimiento 10 veces. 3. Registra el peso en cada ocasión utilizando el siguiente cuadro: Peso en g Pipeta 0.5-10 µL Pipeta 20-200 µL Pipeta 100-1000 µL 1 2 3 4 5 4

6 7 8 9 10

ACTIVIDADES 1. En base a los resultados obtenidos en la tabla 1 discute las posibles causas de obtener volúmenes diferentes a los esperados.

2. Investigue el efecto de la temperatura y la presión atmosférica sobre el peso del agua. 3. Con los datos obtenidos y utilizando las fórmulas siguientes, determina el error sistemático y la exactitud de medición Error sistemático en porcentaje = 100 ( - X nominal / X nominal) Donde:  es el promedio de los datos obtenidos X nominal es el peso teórico del agua destilada bajo las condiciones de temperatura y presión atmosférica utilizadas. En nuestro caso asumimos que 10 µL de agua destilada corresponde a 10 mg de peso Exactitud = 100- Error sistemático en porcentaje CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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