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Universidad Arturo Michelena Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Patología medica Licenciatura en Histotecnologia

CORTES POR CONGELACION

Autor: Yeixandra Pérez CI: 27347051

Valencia, Febrero 2020. CORTES POR CONGELACION Consiste en la congelación del tejido fresco, que detiene los procesos celulares e inmoviliza las estructuras tisulares; con ella podemos evitar la acción química de los fijadores. Por tanto, varias estructuras celulares, entre otros el ADN y el ARN , permanecen preservados. Sin embargo, para que la congelación sea realmente eficaz y los procesos de degradación se detengan completamente, ha de alcanzarse una temperatura de al menos -70 grados centígrados. De esta manera, los cortes congelados se emplean, por ejemplo, para demostrar la localización celular de antígenos para los que los anticuerpos no funcionan en parafina, para demostrar actividad enzimática o para estudiar la presencia en el tejido de lípidos solubles. Por otra parte, los tejidos frescos o previamente fijados, pueden congelarse para así ejecutar algunas tinciones especiales o para obtener un diagnóstico rápido. El proceso de corte de tejidos congelados con dióxido de carbono puede hacerse en:  Microtomo clínico de congelación: Tiene muchas desventajas y dificultades de manejo, que lo hacen obsoleto  Criostato refrigerado mecánicamente. En este sentido, la criofijacion debe ser instantánea, ya que una congelación lenta supone la formación de cristales de hielo que alteran la morfología celular. Por ende, se realiza sumergiendo una pieza pequeña en nitrógeno líquido o, mejor aún, en isopropanol enfriado previamente hasta su punto de congelación (-170 grados centígrados) en nitrógeno líquido. Sin embargo, en la inmersión con isopropanol (también llamado isopentano) frio permite una difusión de la temperatura más homogénea durante la congelación. El tratamiento previo del tejido con agentes crioprotectores (glicerol, dimetilsulfoxido, propilenglicol o sacarosa) permite minimizar la formación de cristales de hielo en el tejido. Una vez congelado, se coloca en una cámara de vacío a baja temperatura y después se seca (se deshidrata) por evaporación lenta (sublimación del agua). En la modificación de

este método, llamada sustitución de la congelación, el hielo del interior del tejido congelado es sustituido por alcohol a muy aja temperatura. El principal inconveniente de la criofijacion es su reversibilidad, ya que, una vez descongelado, el tejido volvería sufrir los procesos de degradación. CRIOSTATO El criostato consiste de un microtomo de tipo rotatorio colocado dentro de un gabinete mecánicamente refrigerado. Se obtienen secciones de un grosor mínimo 6 a 8 micras, pero habitualmente se consiguen cortes algo más gruesos (10-15 micras). Hay muchos criostatos que tienen plataformas o cámaras en las cuales el tejido se congela rápidamente, y las que en su gran mayoría tienen la capacidad de autocongelarse. Dentro del ambiente controlado del criostato: el microtomo, la cuchilla del microtomo, el interior del gabinete, y todos los utensilios, se mantienen a la misma temperatura de operación, de forma tal que el proceso de corte es muy raramente afectado por la temperatura externa. Las plataformas o cámaras de congelación eliminan la necesidad de tener que usar nitrógeno liquido u otros agentes en la gran mayoría de tejidos. -

MANTENIMIENTO DEL CRIOSTATO

El criostato es un instrumento de precisión y debe ser mantenido adecuadamente si se busca una operación optima. Todas las partes movibles deben conservarse limpias, lubricadas y ajustadas correctamente. El hielo acumulado en el gabinete interior debe ser removido diariamente ya que actúa como una cubierta aislante, que hace que la unidad de refrigeración trabaje en exceso. La acumulación de cristales de hielo en las partes movibles hace que el mecanismo se endurezca y sea difícil de operar. El hielo debe ser removido con alcohol absoluto y todas las partes movibles se deben lubricar. Las partículas de tejido que sobren deben ser removidas al terminar el procesamiento, ya que esas partículas pueden adherirse al mecanismo o a la cuchilla y aparecer después contaminando laminas que pertenecen a otros casos.

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CUCHILLAS DEL CRIOSTATO:

La calidad de los cortes esta relacionada directamente con el estado en que se encuentre el filo de la cuchilla. Por razones de seguridad se prefiere las cuchillas mas cortas de 125mm cubriendo el borde la cuchilla con un guardacuchilla, esta debe ser limpiada adecuadamente con xileno seguido de alcohol absoluto removiendo la silicona o aceite, ya que la mayoría están cubiertas de las mismas. -

TEMPERATURA

Cada tipo de tejido tiene una temperatura óptima para el corte, pero es imposible, especialmente durante el corte para diagnostico rápido, el ajustar la temperatura del criostato a cada tejido. Generalmente, están graduadas a -20 grados centígrados. Todos los utensilios: gabinetes, microtomo, cuchilla del microtomo, y en cualquier instrumento (pinzas, pinceles, etc.), deben estar a la misma temperatura. Para una utilización optima es recomendable mantener una cuchilla dentro del gabinete por si la cuchilla regular se malogra para su posterior reemplazo. ADHESIVOS PARA LAS SECCIONES Muy pocas veces hay que usar adhesivos cuando la coloración es H-E y el tejido es fresco. Ya que al momento de la coloración, las proteínas y los líquidos del tejido se coagulan con el primer alcohol o fijador. Por lo tanto, ayuda a que la sección se adhiera bien a la lámina. Sin embargo, cuando se usan coloraciones especiales, el tejido tiende a separarse de la lámina. Por lo tanto se recomienda si las mismas no se pueden adherir espontáneamente el uso de varios adhesivos como lo son: SOLUCION DE ALBUMINA DE HUEVO DE MAYER 

Clara de huevo………… 50ml

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Glicerina………………..50ml

Aplique una capa bien delgada a la lamina inmediatamente antes de usarla SOLUCION DE GELATINA-ALUMBRE DE CROMO 

Gelatina, tipo A, 275 Bloom……….. 3g

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Sulfato potásico de cromo………….. 0,5g

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Agua destilada……………………….1000ml

Caliente el agua a 60 grados centígrados y disuelva la gelatina completamente con la ayuda de un agitador magnético. Añada lentamente el sulfato potásico de cromo (debe adquirir tonalidad azul). Añada unos cuantos cristales de timol como preservativo. Remoje las láminas en la solución tibia, seque los bordes, y luego pare las laminas en uno de sus extremos hasta que se sequen con el aire. Una vez secas, almacénelas en un recipiente a prueba de polvo hasta que se vayan usar OCT (Compuesto de temperatura optima) Normalmente, se incluye la muestra fijada antes de congelarla en un gel que contiene resinas y glicoles solubles en agua. El más común es el llamado «OCT» (del inglés optimum cutting temperature, compuesto para la temperatura óptima de corte). El OCT, al congelarse, proporciona una matriz con la consistencia adecuada para el corte de la muestra mediante criostato. El OCT facilita notablemente el corte a bajas temperaturas y no deja residuos en los portaobjetos durante el procedimiento de tinción. Por tanto, no es necesario incluir un paso de eliminación del OCT de la sección en los protocolos subsiguientes de tinción, inmunohistoquímica. TECNICA DE CORTE 1. Se extiende una pequeña cantidad de un medio de inclusión liquido como el OCT, en la superficie de un botón portaobjeto apropiado. El tejido se coloca en la superficie del botón portaobjeto y se rodea completamente con medio de inclusión.  El medio de inclusión debe proporcionar apoyo adecuado mediante el proceso de corte.  Debe tener márgenes de por lo menos 2mm.  El tejido debe orientarse apropiadamente y con gran cuidado. 2. El botón portaobjeto se coloca en la plataforma de congelación en el criostato. A medida que el tejido se congela, se puede añadir más medio de inclusión, si así es el caso. El proceso de congelamiento puede acelerarse si el botón portaobjeto esta a -20 grados centígrados, que es la misma temperatura de la cámara del criostato.

3. Cuando del tejido está completamente congelado, el botón portaobjeto se monta en la cabeza del microtomo. 4. Rebanamiento preliminar del tejido: a. Ajuste el portacuchilla en tal forma que el tejido roce un poco la cuchilla. b. Desengrane el trinquete de avance automático de la rueda dentada. c. Manualmente avance la rueda dentada hasta que el tejido se extienda sobre el filo de la cuchilla aproximadamente 0.1-0.5mm. la distancia exacta será más fácil de calcular a medida de que se vaya adquiriendo experiencia. d. Suelte el seguro de la rueda volante (la rueda de la manija grande). e. Rote la rueda volante 180 grados en el sentido contrario al de las manecillas del reloj para comenzar el Rebanamiento preliminar. Vuelva inmediatamente la rueda volante a la posición vertical. 5. Embrague el trinquete de avance automático y la rueda dentada. Cuidadosamente limpie el filo de la cuchilla con gasa seca. 6. Afloje la ruedavolante. Muy lenta y suavemente gire la rueda en el sentido de las manecillas del reloj. A medida que la sección se comience presentar en el borde de la cuchilla, use un pincel enfriado para guiarla gentilmente a

lo largo de la

superficie de la cuchilla aplanando en esa forma el tejido. 7. Monte la sección en la lamina portaobjeto acercando gradualmente la superficie de una lamina que este a temperatura ambiente a la sección. Esta parece brincar hacia la lámina, derritiéndose inmediatamente el medio de montaje. 8. La lamina esta lista para ir al fijador o para teñir.

TINCION El siguiente es el procedimiento con hematoxilina y eosina, para todos los especímenes quirúrgicos que hayan sido seccionados a 6micras: 1. Coloque los tejidos frescos en formalina alcoholica por 15seg. 2. Remoje 10 veces en etanol al 70%. 3. Enjuague bien con agua destilada. 4. Tiña con Hematoxilina de Harris por 45seg 1min.

5. Enjuague bien con agua corriente. 6. Remoje veces en la solución saturada de carbonato de litio hasta que la sección se vuelva azul, aproximadamente 30 seg (puede usarse agua amoniacal débil en lugar de la solución saturada de carbonato de litio). 7. Enjuague bien en agua tibia. 8. Contraste en la solución de eosina y floxina por 30 seg. 9. Comience la deshidratación con 5 sumergimientos rápidos en cada uno de los cambios de etanol al 95%. 10. Complete la deshidratación y el aclaramiento en 2 cambios de etanol absoluto y 2 cambios de xileno, 10 remojones en cada soluciones. 11. Monte con medio resinoso....