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PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO PNT-FENOL DETERMINACIÓN DE FENOL EN AGUAS. MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO DIRECTO DE LA 4-AMINOANTIPIRINA Rev.: 1

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ÍNDICE 1. OBJETO .................................................................................................................................................3 2. ALCANCE ...............................................................................................................................................3 3. REFERENCIAS ........................................................................................................................................3 4. FUNDAMENTO......................................................................................................................................3 5. METODOLOGÍA..................................................................................................................................... 3 5.1. MEDIDAS DE SEGURIDAD .............................................................................................................4 5.2. INTERFERENCIAS ..........................................................................................................................4 5.3. TOMA Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA ..................................................................................4 5.4. INSTRUMENTAL ............................................................................................................................4 5.5. REACTIVOS....................................................................................................................................5 5.6. OPERACIONES PREVIAS ................................................................................................................5 5.7. PROCEDIMIENTO ..........................................................................................................................6 5.7.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ...........................................................................................6 5.7.2. PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO .......................................................................6 5.7.3. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS ................................................................................................6 6. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS ...........................................................................................7 6.1. CURVA DE CALIBRADO .................................................................................................................7 6.2. CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA ..............................................................................................7 6.3. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO ......................................................................................7 6.4. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE LAS MEDICIONES.........................................................7 6.5. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS .................................................................................................8 ANEXO: DIAGRAMA DE FLUJO DEL ENSAYO.............................................................................................8

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1. OBJETO El objeto de este PNT es describir el ensayo para la determinación de fenol en agua mediante el método espectrofotométrico directo de la 4-aminoantipirina.

2. ALCANCE Este PNT se aplica a la determinación de fenol en aguas residuales y continentales no tratadas. El rango de ensayo es de 0.5 a 5 mg fenol⋅L-1 y el de medida de 0.5 a 500 mg fenol⋅L-1, siendo la dilución máxima permitida 1:200.

3. REFERENCIAS  American Public Health Association. (1998). Standard methods for examination of water and wastewater. 20th ed. APHA-AWWA-WPCF, Washington DC.  ASTM D1783-01. (2012). Standard test methods for phenolic compounds in water. American Society for Testing and Materials, ASTM.  UNE 77053 (2002). Calidad del agua. Determinación de fenoles. Asociación Española de Normalización y Certificación, AENOR.  USEPA Method 420.1 (1983). Phenolics (Spectrophotometric, Manual 4-AAP With Distillation). United States Environmental Protection Agency, EPA.

4. FUNDAMENTO Este método es sensible a los fenoles –orto- y –meta- sustituidos y, en condiciones adecuadas de pH, los sustituidos en posición –para- por grupos carboxilo, halógeno, metoxilo o ácido sulfónico. Los compuestos fenólicos destilados reaccionan con la 4-AAP a pH 7.9 en presencia de ferricianuro potásico para formar un compuesto coloreado de antipirina. Este colorante es estable en solución acuosa y susceptible de medida fotométrica a una longitud de onda de 506 nm.

5. METODOLOGÍA A continuación se describen las actividades a desarrollar, así como los medios necesarios para llevar a cabo este PNT.

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5.1. MEDIDAS DE SEGURIDAD Durante la destilación de la muestra, debido a las altas temperaturas que adquiere el material, se deben emplear guantes de protección térmicos.

5.2. INTERFERENCIAS Las interferencias potenciales del método pueden deberse a diferentes causas:  Sustancias oxidantes tales como cloro y aquellas capaces de oxidar el yoduro a yodo al acidificar. Se deben eliminar inmediatamente después de la toma de muestra añadiendo un exceso de sulfato ferroso, FeSO4. Si no se eliminan las sustancias oxidantes, los compuestos fenólicos se oxidarán parcialmente.  Especies reducidas de azufre. Se eliminan por acidificación a pH = 4 con ácido fosfórico, añadiendo sulfato de cobre y aireando la muestra brevemente por agitación. De esta manera, se eliminan las interferencias debidas al sulfuro y al sulfito.  Aceites y alquitranes: El aceite o alquitrán se extraen con 50 mL de cloroformo de la solución acuosa, alcalinizada a pH = 12 con hidróxido sódico. Se desecha la fase orgánica que contiene el aceite o alquitrán y se elimina el exceso de cloroformo de la fase acuosa calentando al baño María antes de proceder a la fase de destilación.  También pueden interferir concentraciones anormalmente altas de aminas aromáticas y formaldehído que son eliminadas añadiendo sulfato de amonio e hidróxido de sodio. En ambos casos posteriormente se acidifica y se procede a destilar.

5.3. TOMA Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA En las concentraciones a las que habitualmente se encuentran en las aguas residuales, los fenoles pueden sufrir una oxidación biológica y química. Si no van a analizarse dentro de las 4 h posteriores a su recogida, las muestras deben conservarse acidificadas a pH = 4 con ácido fosfórico y refrigeradas a temperaturas inferiores a 4°C. Las muestras así conservadas pueden almacenarse en botes de vidrio borosilicatado y analizarse dentro de las 24 horas después de su recogida. Si se sabe que hay H2S ó SO2 en la muestra, se airea brevemente o se agita la muestra con precaución.

5.4. INSTRUMENTAL El instrumental necesario para llevar a cabo este PNT es el siguiente:  Material general de laboratorio.  Manta calefactora eléctrica para matraces de 500 mL con Tª regulable hasta 450°C.  Equipo de destilación compuesto por: matraz de 500 mL, pieza acodada de 75° para destilación, refrigerante Dimroth encamisado de 300 mm de longitud y colector de 105°.

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 pH-metro.  Espectrofotómetro UV-visible con las siguientes especificaciones: ancho de cubeta 10 mm y longitud de onda 506 ± 1 nm.

5.5. REACTIVOS Los reactivos que se utilizan durante el desarrollo de este PNT se indican a continuación. Todos ellos deben ser de calidad analítica.  Agua ultrapura (caducidad, 1 día).  Ácido fosfórico (1:10). Diluir 10 mL de H3PO4 al 85% hasta 100 mL con agua ultrapura.  Amoniaco 0.5 M. Diluir 31.6 mL de NH3 al 30% hasta 1 litro (caducidad, 2 meses).  Solución tampón fosfato. Diluir 104.5 ± 0.1 g de K2HPO4 y 72.3 ± 0.1 g de KH2PO4 en agua ultrapura hasta 1000 mL. El pH ha de ser 6.8 (caducidad, 2 meses).  Solución de 4-aminoantipiridina al 2%. Disolver la cantidad necesaria de reactivo ± 0.01 g en el volumen adecuado con agua ultrapura para el análisis diario (caducidad, 1 día).  Solución de ferricianuro potásico al 4%. Disolver la cantidad necesaria de reactivo ± 0.01 g en el volumen adecuado con agua ultrapura para el análisis diario. Almacenar en frasco topacio (caducidad, 1 día).  Patrón concentrado de fenol, 1000 mg fenol⋅L-1. Pesar 0.5 g de fenol, con precisión de ± 0.0001 g, y diluir a 500 mL con agua ultrapura recién hervida y fría (caducidad, 3 meses).  Muestras para el control de calidad interno, CCI. Se prepara una de las siguientes disoluciones a partir de un patrón concentrado de fenol distinto al empleado en la calibración del equipo (caducidad, 1 día): Tabla 1: Concentraciones de las muestras para el control de calidad interno CCI1

CCI2

Volumen (mL) de patrón concentrado enrasar a 1000 mL con agua ultrapura

0.5 mL

5 mL

Concentración final

0.5 mg fenol⋅L

-1

5 mg fenol⋅L-1

5.6. OPERACIONES PREVIAS Se fija en el espectrofotómetro UV-vis la longitud de onda a 506 nm y se ajusta el cero de absorbancia.

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5.7. PROCEDIMIENTO 5.7.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Los fenoles se pueden separar de la matriz no volátil por destilación. Para ello, se toman volúmenes de muestra ligeramente superiores a 500 mL y se ajusta el pH a aproximadamente 4.0 con la disolución de ácido fosfórico. Omitir la etapa de ajuste de pH si la muestra se conserva como se describe en el apartado 5.3. A continuación, se vierten en el matraz de destilación 500 mL de la muestra y cuando han destilado aproximadamente 450 mL, se detiene la destilación. Cuando la muestra deja de hervir, se añade 50 mL de agua desionizada caliente al matraz de destilación y se continua destilando hasta recoger un volumen total de 500 mL. Los destilados se almacenan refrigerados a 4°C hasta su análisis 5.7.2. PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO Se realiza el calibrado instrumental diariamente. Se preparan los patrones de calibrado de forma que se cubra el rango de trabajo mediante dilución de la solución patrón de fenol concentrado. Se toman los siguientes volúmenes de patrón concentrado de fenol: 0 (blanco), 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 y 0.5 mL, y se diluyen a 100 mL con agua ultrapura obteniéndose patrones de 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5 mg fenol⋅L-1 (caducidad, 1 día). Para asegurar la validez de las líneas de calibrado se deberá medir uno de los patrones de calibración al inicio de la sesión de trabajo, cada diez muestras o al finalizar la serie de muestras. 5.7.3. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS Se realizan dos réplicas de uno de los CCI, al inicio de cada sesión de trabajo y al final. Se realizan dos réplicas de cada muestra. Se toman 100 mL de destilado de muestra o de CCI, o una porción que contenga no más de 5 mg de fenol y se diluye hasta 100 mL. Se realiza un blanco paralelamente. Se tratan los patrones de la línea de calibrado, las muestras, el CCI y el blanco como sigue: se añaden 2.5 mL de la disolución de amoníaco y 2 mL de tampón fosfato (pH final aproximadamente 7.9). Se añade a continuación 1.0 mL de disolución 4-AAP, 1.0 mL de disolución K3Fe(CN)6 y se mezcla bien. Después de 15 minutos, se transfiere la disolución coloreada a las cubetas de vidrio de 1 cm y se lee la absorbancia de patrones y muestras a 506 nm introduciendo en la cubeta de referencia el blanco.

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6. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS 6.1. CURVA DE CALIBRADO Realizar el ajuste lineal por mínimos cuadrados: ฀ ฀ = ฀฀0 + ฀฀1 ∙฀฀฀฀฀฀฀฀฀฀ ฀฀

ec. 1

donde A es la absorbancia medida por el espectrofotómetro en unidades de absorbancia, Cfenol es la concentración de analito en mg fenol⋅L-1, b1 la pendiente de la línea de calibrado en UA L⋅mg fenol-1 y b0 la ordenada en el origen de la línea de calibrado medida en UA. La pendiente y ordenada en el origen de la línea de calibrado deben estar incluidas en los intervalos de confianza: 0.13 < b1 < 0.14 UA mg fenol-1 y -0.0086 < b0 < 0.0141 UA. El coeficiente de determinación mínimo debe ser R2 > 0.996. A los patrones de control del calibrado se les permitirá un error respecto al valor real ≤ 5% para concentraciones medias o altas, e inferior al 10% para concentraciones próximas al límite de cuantificación. En caso contrario, no se dará por buena la línea de calibrado almacenada y se recalibrará de nuevo.

6.2. CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA La concentración de anión de la muestra se calcula interpolando en la ecuación de la línea de calibrado: ฀฀฀฀฀฀฀฀฀฀฀฀ (฀฀฀฀ ฀฀฀฀฀฀฀฀฀฀ ∙ ฀฀−1) = ฀฀1

฀฀ − ฀฀0

ec. 2

6.3. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO Los valores obtenidos del análisis de las muestras de control de calidad interno se incluirán en los gráficos de control elaborados durante la validación del método. Se comprobará la validez del método según la tendencia de los valores representados. Si el valor de %DER para una muestra medida es superior al valor objetivo impuesto durante la validación, %DER...