PRÁCTICA 03. Actividad y Especificidad Enzimática PDF

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INTRODUCCION.Las enzimas se describen como catalizadores complejos de origen biológico que permiten un aceleramiento de las reacciones químicas intracelulares a través de vías bien definidas. Sin estas proteínas especializadas, la vida tal como es no podría existir.Para poder mostrar la actividad en...

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Primera Unidad

Enzimología y Metabolismo Energético

INTRODUCCION. Las enzimas se describen como catalizadores complejos de origen biológico que permiten un aceleramiento de las reacciones químicas intracelulares a través de vías bien definidas. Sin estas proteínas especializadas, la vida tal como es no podría existir. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato, entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. La determinación enzimática puede darse empleando mediciones cualitativas y/o cuantitativas; la determinación cualitativa evidencia la presencia de la enzima en el medio que se está trabajando, hecho esto se procede a determinar la cantidad de enzima que se halla presente; que en la mayoría de los casos es imposible determinarla en términos absolutos por la mezcla compleja de diversas proteínas que se encuentra en el medio, pero se hace midiendo la actividad enzimática en unidades que en condiciones habituales es directamente proporcional a la cantidad de enzima. La determinación cualitativa de la actividad enzimática de cualquier sistema puede ser demostrada de dos maneras: 1) Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. 2) Verificando los productos liberados después (PRODUCTOS FORMADOS) de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura. FINALIDAD. ▪ Determinar la actividad enzimática, utilizando la amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa; verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE. ▪ Comprende como se demuestra la capacidad catalítica de una enzima determinando la presencia del sustrato residual y la presencia de productos formados en la reacción. MATERIAL Y EQUIPO. ▪ Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas. ▪ Equipos: baño para agua hirviendo, baño maría. ▪ Reactivos: • Solución de almidón pH 6.0 al 1%. • Cloruro de sodio solución 0.1M • Enzima al 1% (amilasa salival). • Ácido Clorhídrico 0.05N • Solución yodada. • Reactivo Folin Wu: o Solución Cúprica alcalina. o Solución fosfomolíbdica. PROCEDIMIENTO y RESULTADOS. 1) Rotular previamente los tubos de ensayo. 2) Preparar el SISTEMA A, Colocando lo que se indica: TUBOS DE ENSAYO I II Solución de almidón pH 6.0 al 1% 5.0 5.0 Solución de Cloruro de sodio 0.1M 1.0 1.0 Agua destilada 4.0 3.0 Mezclar y colocar los tubos a incubación por cinco minutos a 37 °C Agregar: Amilasa Salival al 1.0% -1.0 Mezclar y continuar la incubación por 10 minutos (computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado al tubo). Observe los resultados. COMPONENTES (en ml)

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3) Realizar el control de la actividad enzimática: a. SUSTRATO RESIDUAL: este procedimiento se lleva a cabo en base al empleo de la reacción del almidón con el yodo. Cumplidos los 10 minutos de incubación, sacar los tubos y armar una nueva serie agregando: COMPONENTES (en ml)

TUBOS DE ENSAYO

II Ácido Clorhídrico 0.05N 5.0 Incubado de cada uno de los tubos del preparado 0.5 0.5 anterior (Sistema A) Solución Yodada 0.5 0.5 Observe los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos, valorando los cambios de coloración (azul oscuro, azul claro, sin color).

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b. LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin Wu), el cual se realiza en base a la capacidad reductora de los productos que se forman en la reacción. para lograr esta reacción se arma la siguiente serie: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml) I II Incubado correspondiente del Sistema A 1.0 1.0 Solución cúprica alcalina 1.0 1.0 Mezclar por inversión y colocarlos en baño de agua hirviendo por 8 minutos. Sacar los tubos y enfriarlos con agua corriente. Observe los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos, mediante la formación de precipitado.

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ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO. 1. Explique bioquímicamente lo observado en los pasos 2, 3a y 3b. PREGUNTAS DE APLICACIÓN. 1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica. 2) Elabore un cuadro comparativo con la definición de los métodos para determinar la actividad enzimática empleado en la práctica. 3) Confeccione un mapa mental y defina que es la energía de activación y el estado de transición. 4) En un cuadro elabore una lista de los componentes del sistema enzimático empleado e indique el rol que desempeñan. 5) Elabore un mapa mental y explique el fundamento bioquímico de los indicadores que se emplearon para la observación de la reacción en el sustrato residual y en los productos formados. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019. 2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 7ma Edición, Editorial Omega, España, 2018. 3) Alpaca H, J García. Guía de Práctica de Bioquímica. UNT 2007.

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INTRODUCCION. Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energía más rápidamente debido a la presencia de las enzimas (catalizadores biológicos) con alto grado de especificidad y eficiencia. Como sucede con los catalizadores inorgánicos, las enzimas modifican la velocidad de una reacción química sin afectar el equilibrio final y sólo se requieren pequeñas cantidades para efectuar la transformación de un gran número de moléculas de sustrato. Sin embargo, a diferencia de la gran mayoría de catalizadores inorgánicos, las enzimas son bastante especificas ya que catalizan un número comparativamente pequeño de reacciones y en algunos casos tener sólo una reacción. Con esta actividad se estudiará la especificidad de la amilasa sobre el almidón, para detectar la actividad enzimática se empleará la identificación de la presencia del sustrato mediante la reacción IKI y la del producto mediante la reacción de Benedict. La reacción IKI (yodo-yoduro de potasio) detecta la presencia de almidón; mediante el viraje de color caramelo a un color azul oscuro; el reactivo de Benedict detecta la presencia de azúcares reductores (glucosa o maltosa) mediante un cambio de color azul brillante a verde anarajando o marrón rojizo. FINALIDAD. ▪ Determinar la especificidad enzimática, utilizando la enzima amilasa salival frente al almidón, celulosa y una suspensión de bacterias y comparar si la peptidasa, puede actuar sobre el almidón. COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE. ▪ Comprende como se determina la especificidad catalítica de una enzima determinando la presencia del sustrato residual y la presencia de productos formados en la reacción. MATERIAL Y EQUIPO. ▪ Simulador de Laboratorio: Physio ExTM 10.0 ▪ Reactivos: • Solución de amilasa. • Solución de almidón. • Solución tamponada pH 7.0 • Solución de glucosa. • Solución de celulosa. • Solución de peptidasa. • Agua destilada. • Suspensión de bacterias. • Solución IKI. • Reactivo de Benedict PROCEDIMIENTO. 1) Accede al programa Physio Ex, mediante el siguiente enlace: https://media.pearsoncmg.com/bc/bc_0media_ap/physioex/10/ex8/act2/ 2) Pulsa en la pestaña Experimento (Experiment) para comenzar, hasta que en la pantalla aparezca el equipo para el trabajo. 3) Arrastre un tubo de ensayo hasta la primera ranura (1) de la unidad de incubación, los demás se colocan automáticamente. 4) Añade a los tubos de ensayo lo que se indica a continuación: TUBOS DE ENSAYO (Componentes) I II III IV V VI Amilasa Amilasa Amilasa Celulosa Peptidasa Bacterias Almidón Glucosa Celulosa Tampón pH 7.0 Almidón Celulosa Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 Agua destilada Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 (para añadir una sustancia a un tubo de ensayo, del estante de soluciones arrastre el tapón cuentagotas del frasco correspondiente, hasta la parte superior del tubo de ensayo).

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Pulse en Incubar (Incubate) para iniciar la incubación. La temperatura debe estar en 37°C y el temporizador fijado en 60 minutos (la simulación comprime el período de tiempo de 60 minutos hasta 10 segundos de tiempo real). La unidad de incubación agitará suavemente el soporte de los tubos y mezclará de manera uniforme su contenido durante la incubación. Transcurrido el tiempo de incubación, el soporte de los tubos de ensayo subirá automáticamente y las puertas del armario de análisis se abrirán. Arrastre el primer tubo desde la unidad de incubación hasta el primer tubo de ensayo en el armario de análisis, para decantar la mitad de su contenido, la decantación para el resto de los tubos se repite automáticamente. Arrastre el tapón cuentagotas del frasco del reactivo IKI hasta el primer tubo de ensayo del armario de análisis y coloque una gota; el proceso para el resto de los tubos se repite automáticamente. Observe el cambio de color en los tubos y pulse Guardar Datos (Record Data) para mostrar los resultados en la pantalla.

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Arrastre el tapón cuentagotas del frasco del reactivo de Benedict hasta el primer tubo de ensayo de la unidad de incubación para añadir cinco gotas de reactivo. Automáticamente se añadirán gotas de reactivos a los demás tubos. 10) Pulse en Hervir (Boil). El soporte de los tubos bajará sumergiendo los tubos en la unidad de incubación y el contenido de los tubos hervirá durante unos minutos. 11) Observe el cambio de color en los tubos y pulse Guardar Datos (Record Data) para mostrar los resultados en la pantalla. 9)

ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO. ▪ Anote los resultados observados en el paso 8 y 11 en la siguiente tabla: Tabla Especificidad de la amilasa sobre el almidón Tubos I II III IV Ensayo IKI Test Benedict ▪ Explique bioquímicamente lo observado.

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PREGUNTAS DE APLICACIÓN. 1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la simulación. 2) Elabore un mapa conceptual y explique si la celulosa actúa como sustrato de la amilasa. 3) Mediante un mapa conceptual explique el efecto que tuvo la adición de bacterias sobre la digestión de celulosa. 4) Elabore un mapa conceptual el efecto que tuvo la adición de peptidasa sobre el almidón. 5) Mediante un gráfico explique cuál es la menor unidad monomérica formada por digestión del almidón REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019. 2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 7ma Edición, Editorial Omega, España, 2018. 3) Alpaca H, J García. Guía de Práctica de Bioquímica. UNT 2007. 4) Zao P, Stabler T, Smith L, Lokuta A, E Griff. Physio ExTM 9.0 Simulaciones de Laboratorio de Fisiología, España 2012.

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