Práctica 1: Método de Lowry PDF

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Determinación de Proteínas por el método de lowry...

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS PRÁCTICA No. 1: “Determinación de Proteínas por el método de lowry”

Alumna: López Ramírez Stephany

Grupo: 5QM1 Carrera: Químico Bacteriólogo y Parasitólogo Asignatura: Laboratorio de Métodos de Análisis

Sección 2 Profesor: Francisco Fernández Lopez

Fecha de entrega: 6 de mayo de 2015

Introducción Método de Lowry: Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Objetivos El alumno:    

Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico. Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry. Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color. Analizara las ventajas y desventajas del método de lowry, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas.

Resultados Tubo No.

A 590

Cantidad de proteína (µg)

serie A

serie B

1

25

0.095

0.073

2

50

0.13

0.135

3

75

0.191

0.206

4

100

0.238

0.275

5

125

0.305

0.317

Tabla 1.1 Datos para la curva de calibración de albúmina. 0.35 0.3

f(x) = 0 x + 0.02 R² = 0.98

Absorbancia

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 20

40

60

80

100

Cantidad de proteína (µg)

Gráfica 1.1 Curva de calibración de albúmina.

120

140

Tubo No.

A590

Cantidad de proteína (µg)

1 2

0.172 0.125

64.74 44.30

3 4 5

0.183 0.196 0.183

69.52 75.17 69.52

6 7 8

0.203 0.191 0.192

78.22 73.00 73.43

9 10

0.185 0.204

70.39 78.65

Tabla 1.2 Réplicas para el análisis estadístico.

y=mx + b y=0.0023 x +0.0231

Ecuación de la recta.

m=0.0023 Pendiente b=0.0231Ordenada al origen

r 2=0.9825 Coeficiente de correlación x=

X 69.70

y−0.0231 0.0023

Ecuación para calcular la cantidad de proteína

S

S2

%CV

9.87

97.51

14.17

µ 76.76 (+) 62.63 (-)

Tabla 1.3 Resultados del análisis estadístico.

Desviación Estándar

Media

Coeficiente de variación

Tubo No. 1 2 3 4 5

Sustancia

A590

Glicerol 1% SDS 10% Fenol 1% Tris 1M pH 10 (NH4)SO3 3%

0.209 0.191 1.728 0.172 0.173

Cantidad de proteína (µg) 80.83 73.00 741.26 64.74 65.17

Tipo de interferencia generada POSITIVA NO INTERFIERE POSITIVA NO INTERFIERE NO INTERFIERE

Tabla 1.4 Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el Método de Lowry.

Discusión: En la gráfica se observa la curva de calibración obtenida para el método de Lowry. La cual se puede observar que esta obedece a la ley de Bouger- Beer ya que a tendencia de la curva estándar es en forma creciente. Este aumento progresivo en forma proporcional de las concentraciones de proteína con respecto a las absorbancias dadas por el equipo fotométrico, aunado al cumplimiento de la ley de Bouger – Beer reflejan que a mayor intensidad de color la absorbancia del analito aumenta y por lo tanto su concentración lo hace de la misma manera de forma directamente proporcional. De igual manera las interferencias utilizadas para este método en su mayoría no lo afectan o lo afectan de manera positiva excediendo el rango más alto de los límites de confianza, el método de lowry es un método que se a probado teóricamente es bastante confiable, sin embargo es un método que lleva bastante tiempo y su sensibilidad es baja razón por la cual se somete a dos procesos, es de un costo relativamente bajo y como desventaja tiene que el el color de los analitos al producirse la reacción no es constante y, por tanto; es necesario elegir correctamente los estándares de comparación para asegurar la eficacia del método.

Conclusión:  

El método de lowry es bastante confiable en comparación con otros métodos de determinación de proteínas. La curva de calibración obtenida cumplió con la ley de Bouger – Beer.

Bibliografia 

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http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M %C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE %C3%8DNAS.pdf http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/4.pdf...