Práctica 2. Extracción de DNA tomate PDF

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La obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN), es el punto de partida para la mayoría de análisis
genéticos, estos análisis dependen de los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos, en general este
consiste de cinco pasos; lisis de células, eliminación de proteínas, eliminación del A...

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Ciencias de la Salud

Práctica 2: “Extracción de ADN” Gabino Bello Karen Rubi, Jiménez Ramírez Carolina, Martínez Gopar Karen Denisse, Rayón Rodríguez Xanat Alejandra y Sánchez Ortiz Sarai Asignatura: Biotecnología Forense Licenciatura de QFBT Periodo C2 - 2021 Fecha de entrega: 25 de agosto de 2021 Docente: Dr. Silva Escobedo Jesús Gabriel RESUMEN La obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN), es el punto de partida para la mayoría de análisis genéticos, estos análisis dependen de los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos, en general este consiste de cinco pasos; lisis de células, eliminación de proteínas, eliminación del ARN, eliminación de proteínas y concentración del ADN. Durante la elaboración experimental casera se aisló el ADN de un tomate por medio de un tampón de lisis preparado con sal, bicarbonato de sodio y detergente líquido para trastes, para posteriormente extraerse con alcohol. Finalmente se obtuvo la interfase etanol-agua en donde se logró obtener el ADN del tomate por medio del precipitado; el cual se observa como “filamentos de color blanco”. Cabe destacar que el alcohol usado durante la experimentación es lo más frío posible, esto debido a que la baja temperatura ralentiza la actividad enzimática. Palabras Clave: ADN, etanol-agua, lisis de células, eliminación del ARN, eliminación de proteínas y concentración del ADN. INTRODUCCIÓN El ADN fue aislado por primera vez en 1869 por el médico alemán Friedrich Miescher. La sustancia obtenida se encontró solamente en el núcleo, razón por la que fue originalmente llamada nucleina; posteriormente este término ha sido modificado hasta llegar a su denominación actual de ácido desoxirribonucleico (ADN). En 1944, Oswald Avery definió el ADN como un vehículo de transferencia generacional de rasgos heredables. En 1953, James Watson y Francis Crick dilucidaron la estructura de la molécula del ADN como una doble hélice, avance que permitió no solo conocer la naturaleza de la

molécula, sino también explicar sus propiedades individuales y su papel en la determinación de características genéticas (Fonseca Mendoza and Mateus, 2010). El análisis de la molécula de ADN constituye una herramienta muy valiosa que ha permitido delinear estrategias aplicadas a la investigación básica y al diagnóstico de innumerables entidades de origen genético, basado esto en el principio de que la molécula de ADN es única en cada individuo (excepto en gemelos monocigotos) y contiene toda la información necesaria para el desarrollo y función de los

UVM Lomas Verdes organismos (Fonseca Mendoza and Mateus, 2010). El ADN puede ser extraído de muchos tipos de materiales biológicos (sangre, tejido, hueso, diente, líquido amniótico, etc.) y el éxito del análisis molecular depende de su adecuado aislamiento en términos de cantidad, calidad y pureza; es necesario separar el ADN del resto de los componentes celulares, así como del material no biológico que pueda estar presente (Fonseca Mendoza and Mateus, 2010). El ADN genómico puede ser empleado para la construcción de bibliotecas, en análisis de hibridación, como molde en reacción de amplificación y secuenciación, entre otras aplicaciones. Los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos, sin importar el tipo o procedencia siguen siempre cinco etapas básicas (Giraldo Giraldo, 2010): 1. LISIS DE LAS CÉLULAS

Ciencias de la Salud lisis con detergentes como el SDS en presencia de la proteinasa K en un solo paso. Adicionalmente, la digestión se acompaña del uso de la sal disódica del ácido etiléndiamino.tetra-acético (EDTA) para inhibir la acción de las ADNasas. Alternativamente, para organismos ricos en glicoproteínas como las micobacterias y tripanosomas, entre otros, luego de la digestión se realiza un tratamiento con el detergente catiónico bromuro de hexadecil-trimetil-amonio (CETAB) en presencia de NaCl 0.7 M, con el fin de eliminar las glicoproteínas y obtener ADN más puro (Puerta B. and Ureña P., 2017). 3. ELIMINACIÓN DE ARN Se realiza mediante digestión del ARN con ARNasas como la ribonucleasa A de páncreas bovino. Este paso en algunos protocolos se lleva a cabo después de la extracción del ADN (Puerta B. and Ureña P., 2017). 4. ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS

Entre los métodos de lisis más utilizados están: Detergentes: Los detergentes aniónicos se utilizan básicamente para extraer ADN de parásitos, células en cultivo y tejido, siendo el dodecil sulfuro de sodio (SDS), nonidet-P40 (NP40) y sarkosil unos de los más utilizados para este proceso. Enzimas: Se utilizan especialmente para la extracción de ADN bacteriano, total o plasmídico, siendo la lisozima la enzima de elección. La lisozima actúa desestabilizando la pared celular de bacterias Gram negativas ya que rompe las uniones glucosídicas entre los polisacáridos N-acetilglucosamina (NAG) y el ácido N-acetilmurámico (NAM). Agentes denaturantes: Se utilizan para extraer ADN de diferentes tipos celulares y tejidos, siendo el cloruro de guanidina uno de los más empleados (Puerta B. and Ureña P., 2017). 2. ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS Se lleva a cabo mediante el uso de enzimas proteolíticas tales como la proteinasa K. Algunos protocolos de extracción realizan la

La desproteinización se lleva a cabo con solventes orgánicos tales como el fenol y el cloroformo, los cuales tienen la propiedad de desnaturalizar las proteínas. El fenol debe ser bidestilado, equilibrado y protegido contra la oxidación mediante la adición de 8hidroxiquinolina. Por su parte, al cloroformo se le adiciona alcohol isoamílico en proporción 24:1 volumen a volumen (v:v) de la muestra que se pretende limpiar, quedando las proteínas denaturadas en la interfase y el ADN en la fase acuosa (Puerta B. and Ureña P., 2017). Generalmente se recomienda realizar una extracción con fenol, seguida de una extracción con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y finalmente una última extracción con cloroformo- alcohol isoamílico para limpiar toda traza de fenol (Puerta B. and Ureña P., 2017). 5. CONCENTRACIÓN DEL ADN Se logra mediante precipitación con etanol en presencia de cationes monovalentes a concentraciones de 0.1 a 0.5 M. El etanol en la presencia de estos cationes induce un cambio

UVM Lomas Verdes estructural en el ADN que causa la agregación y precipitación de este. Adicionalmente, con este tratamiento se remueven los residuos de fenol y cloroformo del paso anterior. Entre las sales más utilizadas se encuentran el acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro de litio (Puerta B. and Ureña P., 2017). La diferencia entre cada método radica en el pre-tratamiento que se emplee, lo cual dependerá del origen del material; además deberá tenerse en cuenta de que método de purificación tiene que ser perfectamente compatible con el uso futuro que se piensa dar al ADN o ARN purificado (Giraldo Giraldo, 2010). El ADN puede aislarse mediante ruptura de tejidos y luego aprovechando las diferencias en las propiedades de los ácidos nucleicos, las proteínas y además constituyentes celulares.Tras la lisis celular se trata de inhibir las nucleasas, ya que estas degradaron el material a purificar, para luego desproteinizar la muestra, ya sea mediante métodos químicos (solventes orgánicos, detergentes no iónicos) o enzimáticos (proteasas) (Giraldo Giraldo, 2010). OBJETIVOS General ●

Conocer y comparar diferentes métodos de aislamiento de DNA. ● Obtener una muestra de DNA. Específico ●

Extraer el DNA con EtOH posterior a la obtención.

Ciencias de la Salud HIPÓTESIS Si se rompe la membrana y pared celular, entonces se logrará extraer el DNA, además de purificar los ácidos nucleicos mediante la extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos y su recuperación al precipitarlo con alcohol. JUSTIFICACIÓN La función del DNA es la de almacenar y transferir la información genética que conforma a un organismo y a su descendencia. El genoma de un individuo comprende la totalidad de la información genética contenida en el DNA. El DNA junto con los tres tipos de RNA (rRNA, tRNA y mRNA) participa en la biosíntesis ordenada de los componentes de la célula, codificando la expresión espacio temporal de las proteínas y respondiendo a los estímulos del medio ambiente. El DNA se encuentra en el interior del núcleo de las células eucariotas rodeado de proteínas (histonas) que lo mantienen unido y compactado. Por lo tanto, en la práctica para poder aislar y observar el ADN, se deberá deshacer la membrana plasmática y la envoltura nuclear donde también se precisa la desnaturalización de las proteínas.

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Ciencias de la Salud MÉTODO

UVM Lomas Verdes RESULTADOS

Figura 1. Interfase entre el alcohol y la muestra.

Figura 2. ADN recolectado del jitomate. ANÁLISIS DE RESULTADOS La extracción de ADN se realiza con la finalidad de hacer estudios genéticos, de forense y biología molecular. Para los estudios genéticos más profesionales, se requieren protocolos especiales con diversos pasos y materiales que requieren de un equipo y/o manejo de manejo. Sin embargo, se puede

Ciencias de la Salud realizar una extracción de ADN a partir de materiales que se encuentran en el hogar. Por lo tanto, para llevar a cabo el desarrollo de esta práctica, se recurrió a realizar una extracción de ADN casera, en este caso la extracción se le realizó a un jitomate. Inicialmente se hizo uso de un medio mecánico, en este caso se utilizó una licuadora, esto con el fin de poder hacer la ruptura del tejido del jitomate y por ende, romper las células y así liberar a los organelos, esta homogeneización facilita el efecto de lisis o ruptura que ayuda a liberar el material genético. Posteriormente se hizo uso una solución de lisis, cuyo objetivo es poder romper las membranas de los organelos y así poder extraer el ADN, esta solución está compuesta por diversos ingredientes como lo son: agua, sal de mesa, bicarbonato sódico y detergente, y cada uno de estos compuestos tiene una función que ayudará a romper las membranas y obtener el ADN. En este caso, el agua actúa como disolvente, formando una mezcla homogénea, ya que las moléculas polares que la forman establecen interacciones electrostáticas (a través de puentes de hidrógeno) unas con otras y con todas las moléculas cargadas o polares. El ADN forma puentes de hidrógeno con el agua a través de las cargas negativas de sus fosfatos, de esta manera, se puede comprender que el ADN permanece disuelto mientras interacciona electrostáticamente con el agua. Por otro lado, la sal común se encuentra en una concentración saturante (en exceso respecto al disolvente), lo que aumenta la fuerza iónica: debilita las interacciones iónicas entre biomoléculas (como entre el ADN y las proteínas asociadas a él) y aumenta las interacciones hidrofóbicas entre proteínas, provocando su coagulación. El detergente añadido en la solución de lisis ayuda a disolver la membrana celular que es una bicapa lipídica, esto es posible ya que el detergente está formado por moléculas anfipáticas, Esta característica le permite solubilizar la grasa a través de la formación de micelas. Las que las partes apolares de las moléculas de detergente interactúan con la grasa, disolviéndola y manteniéndola en suspensión, mientras que las partes polares

UVM Lomas Verdes interactúan con el agua. Cuando el detergente disuelve las membranas biológicas, se introduce entre los fosfolípidos de las membranas, rompiéndolas y formando micelas solubles. El bicarbonato sódico actúa manteniendo el pH constante (pH=6.5, aproximadamente), evitando la degradación de las biomoléculas como el ADN. El paso posterior a añadir la solución de lisis fue añadir el alcohol, en este paso es importante realizarlo de una manera lenta y dejando resbalar al alcohol por las paredes del recipiente para que quede en la superficie del agua y no se mezcle con ella, ya que ambos compuestos son miscibles, una vez que se añadió el alcohol ya se puede observar el ADN en la interfase, tal y como se muestra en la figura 1, en este paso la sal común de la solución de lisis también es clave en la fase de precipitación del ADN que se produce tras añadir lentamente el alcohol, esto porque las moléculas de alcohol se unen a las de agua, desplazando así tanto el agua que interacciona con el ADN y como la que interacciona con los iones de Na+ , y que hace posible su disolución. Este desplazamiento permite que algunos iones Na+ se unan a los iones fosfato del ADN, neutralizando su carga, perdiendo su solubilidad y facilitando la precipitación del ADN como filamentos blancos (color debido a la red cristalina que forma con el NaCl). Finalmente se extrajo el ADN del tubo y se colocó sobre una caja Petri como se muestra en la figura 2. CONCLUSIÓN El método utilizado para la extracción de ADN con material cotidiano funciona eficientemente a partir de muestras como tomate u otras verduras y frutas suaves, con sólo realizando la

Ciencias de la Salud disolución de lisis, maceración de la muestra de origen vegetal, mezcla, agitación, filtración y recolección. Es de gran importancia considerar la sencillez de dicho método ya que, la membrana biológica de la muestra vegetal debido a su carácter anfipático hace que un detergente sea la sustancia adecuada para disgregarla. Finalmente, para optimizar su extracción, es recomendable que el proceso y EtOH que se utilice esté lo más frío posible. La baja temperatura ralentiza la actividad enzimática, evitando que las moléculas biológicas, como el ADN, sean degradadas tras la ruptura de las membranas celulares que conlleva la liberación de los componentes subcelulares. REFERENCIAS [1] Fonseca Mendoza, D. and Mateus, H., 2010. Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular: Su Aplicación en Genética Básica. [2] Giraldo Giraldo, G., 2010. Laboratorio de Bioquímica: Una Visión Práctica. [3] Puerta B., C. and Ureña P., C., 2017. Prácticas de biología molecular. [4] Sánchez Enríquez, S.; Flores Alvarado, L. J. et al. (2014). Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica. México: McGRAWHILL. [5] Marcos-Merino J.M., Esteban Gallego R. y Gómez

Ochoa

de

Alda

J.

(2019).

EXTRACCIÓN DE ADN CON MATERIAL COTIDIANO: ESTRATEGIA PARTIR

DE

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CIENTÍFICOS. Educación Química. Vol. 30. Núm. 1. Págs. 58-68. Enero 2019...