01 Practica Extraccion de DNA y electroforesis old PDF

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I.- ACIDOS NUCLEICOS EXTRACCIÓN DE DNA En esta práctica se va a aislar DNA, la molécula que contiene la información necesaria para obtener proteínas y que es heredada de una generación a la siguiente. El DNA es una macromolécula compuesta por dos polímeros de desoxirribonucleótidos que forman una doble hélice. Las macromoléculas de DNA son las que tienen un mayor tamaño de todas las que podemos encontrar en los seres vivos. En las células el DNA se encuentra acomplejado con proteínas que permiten empaquetarlo para que ocupe un menor espacio. Por ejemplo, la longitud del DNA humano completamente extendido es de dos metros pero al compactarse en los cromosomas se reduce a unas pocas micras, una millonésima parte. Durante la extracción, es preciso separarlo de las proteínas para poder obtenerlo puro. Debido a que el DNA es la molécula que almacena la información precisa para que un ser vivo pueda llevar a cabo todas las funciones, su aislamiento de células y tejidos es el primer paso en muchas investigaciones en biología. Actualmente, la caracterización del DNA es también un requisito previo en diversos campos de investigación aplicada como en medicina, biotecnología o criminología para, por ejemplo, investigar en nuevas terapias, mejorar cosechas o identificar individuos. Materiales: Guisantes (frescos o congelados) Agua destilada Cloruro sódico Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) SDS en una solución al 10% Ácido clorhídrico Batidora de brazo Pipetas Pasteur Tubos de ensayo Vasos de precipitados Embudos Papel de parafilm o film plástico transparente Gasas, papel de filtro Termómetro 0-100ºC Baño termostatizado Mechero Bunsen Hielo picado OBJETIVOS  Se extraerá DNA de un material biológico  Se estudiará el efecto de la temperatura, el pH y la disgregación mecánica sobre la extracción

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INTRODUCCIÓN La información que permite vivir a los seres vivos está contenida en los ácidos nucleicos. Estos son macromoléculas compuestas por nucleótidos, que tienen en su estructura un azúcar (ribosa o desoxirribosa), una base nitrogenada (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo) y un grupo fosfato.  &

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Figura 1 Los nucleótidos que componen la molécula de DNA están compuestos de un azúcar, la desoxirribosa, una base nitrogenada, que puede ser adenina, citosina, guanina o timina, y un grupo fosfato. Estos desoxinucleótidos forman polímeros a través de enlaces fosfodiester que se establecen entre el azúcar de un nucleótido y el grupo fosfato del siguiente dando lugar a la molécula de DNA. En la célula este proceso es catalizado por unas enzimas denominadas DNA polimerasas. La estructura final en forma de doble hélice se produce al establecerse puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas de una de las cadenas con las bases nitrogenadas de la otra. Entre una adenina y una timina se establecen dos puentes de hidrógeno mientras que entre una guanina y una citosina se establecen tres puentes de hidrógeno. En principio, según el azúcar que forma su esqueleto se distinguen dos tipos de ácidos nucleicos: el DNA, con desoxirribosa y el ARN, con ribosa. El DNA contiene la información genética necesaria para la síntesis de las proteínas que forman los seres vivos y llevan a cabo todos los procesos fisiológicos de los seres vivos. El ARN tiene diversas funciones siendo una de las principales el transporte de la información desde el DNA hasta la maquinaria donde se producen las proteínas. A nivel estructural encontramos que mientras   !"# " 

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el DNA se encuentra mayoritariamente formado por una doble hélice con dos hebras complementarias, el ARN está formado por moléculas de una sola hebra que se pliegan sobre sí mismas adquiriendo estructuras internas. 

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Figura 3

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La disposición de las bases nitrogenadas a lo largo de la hebra de DNA es lo que se conoce como secuencia. De esta forma y sabiendo que la base complementaria a una adenina es una timina (y viceversa) y que a la base complementaria a una guanina es una citosina (y viceversa) es posible deducir la secuencia de la hebra complementaria a partir de una de las hebras. Representación de la doble hélice de DNA en forma de secuencia:

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Nombre científico Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Fugu rubripes Oryza sativa Strongylocentrotus purpuratus Zea mays Homo sapiens Allium cepa Amoeba dubia

Tamaño del genoma (Mb) 12 97 125 180 400 450 900 2.400 3.400 18.000 686.000

Aunque el objetivo de esta práctica es aislar DNA de un material biológico es importante aclarar que cuando hablamos del DNA hemos de diferenciar el DNA genómico, que se encuentra en el núcleo y contiene la mayoría de los genes, de los DNAs extranucleares, que se encuentran en la mitocondria y el cloroplasto y contienen la información de ciertas proteínas necesarias para el funcionamiento de esos orgánulos celulares. El método que se va a emplear es el utilizado para extraer DNA genómico y consta de varios pasos, el primero de los cuales es la homogeneización del material empleado de manera mecánica en presencia de detergentes. Mediante esta combinación de acción mecánica y detergentes se rompen las distintas membranas de la célula (citoplásmica y nuclear) y se libera el DNA al medio de lisis. Los detergentes, además, tienen una actividad inhibitoria sobre algunas proteínas de tal manera que impiden la acción de las enzimas que degradan el DNA liberadas al romperse los lisosomas de la célula. A continuación, se eliminan los grandes fragmentos de restos de tejido y células por medio de una filtración,

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recuperándose el DNA y las proteínas en la solución acuosa. Finalmente se recupera el DNA por medio de una precipitación alcohólica con etanol o isopropanol. PARTE EXPERIMENTAL 1. Homogeneización del material elegido en solución de lisis La solución de lisis tiene tres componentes: a.- un detergente (generalmente SDS), cuya función es romper las bicapas lipídicas de las membranas y unirse a las cargas positivas de las proteínas cromosómicas liberando el DNA a la solución acuosa. La concentración final en la solución de lisis es del 1%. Es posible utilizar un detergente para lavar los platos comercial como sustituto del SDS en la misma concentración final. 2+

b.- ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), que se encarga de secuestrar los cationes Mg que las enzimas que degradan el DNA necesitan para llevar a cabo su actividad. La concentración final es de 0.3%. c.- cloruro sódico, mantiene la doble hélice del DNA y actúa sobre las histonas liberándolas del DNA. La concentración final en la solución es de 0.9%.

Para preparar un litro de la solución de lisis tomar 80 ml de agua y añadir 0.9 gr de NaCl, 0.3 gr de EDTA y 1 ml de una solución al 10% de SDS (para prepararla añadir 10 gr de SDS a 100 ml de agua o 10 ml de detergente comercial a 90 ml de agua). Agitar hasta disolver los componentes y añadir agua hasta los 100 ml. Tomar 25 g de guisantes congelados y añadir 50 ml de la solución de lisis. La extracción que se va a realizar es aplicable a otros materiales como fresas, cebolla, páncreas o timo. Hay que tener en cuenta en caso de utilizar otros materiales que si son de gran tamaño previamente ha de cortarse con un cuchillo o bisturí en piezas más pequeñas (alrededor de 1 cm 2). La homogeneización se realiza con una batidora de brazo tipo minipimer a máxima velocidad durante un tiempo máximo de cinco segundos. Un método alternativo en el caso de emplear materiales de origen vegetal es realizar la homogeneización en un mortero con un poco de arena estéril. Colocar el material en pequeñas piezas y machacarlo con la mano hasta conseguir una pasta. Incubar la solución durante 15 minutos a 55 ºC para acabar de lisar las células y liberar el DNA. Si no se dispone de estufa se puede poner al baño maría en agua caliente controlando la temperatura con un termómetro de tal forma que la temperatura oscile entre o 50 y 60 C. Agitar suavemente de vez en cuando. Pasados los 15 minutos colocar el vaso de precipitado en hielo para disminuir la temperatura durante 10 minutos. 2. Filtración del homogeneizado Preparar un filtro en un embudo colocando una triple capa de gasa o un filtro para hacer café. Colocar el embudo sobre un vaso de precipitado y pasar la solución a través del filtro. Las piezas grandes no lisadas quedarán en el filtro mientras que la solución acuosa pasará al vaso de precipitado.

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3. Precipitación del DNA En este paso se añade una capa de etanol sobre la solución acuosa que contiene el DNA. El DNA posee muchos grupos fosfato por lo que es una molécula muy polar. Debido a esta polaridad, es soluble en agua pero no en alcohol. En la interfase entre ambas soluciones al mezclar suavemente se provoca que el DNA precipite en el etanol y se puedan “pescar” sus largas hebras con una pipeta pasteur. Tomar un volumen de la solución recuperada (3 ml por ejemplo) y añadir dos volúmenes y medio de etanol enfriado a –20 ºC (en el congelador). En su defecto, el etanol puede ser enfriado en hielo (0 ºC). Añadir el alcohol de manera suave y poco a poco dejando que resbale lentamente por las paredes del vaso manteniendo éste inclinado. El etanol queda en la fase superior mientras que en la interfase entre el etanol y la solución acuosa aparecerá una capa blanca de textura filamentosa que es el DNA. Para recuperarlo vamos a hilar sus finas hebras sobre una varilla o el extremo fino de una pipeta pasteur obteniendo como producto un ovillo de DNA. Introducir la punta de la varilla hasta justo debajo de la línea de interfase entre el etanol y el agua. Rotar suavemente y poco a poco se irán enrollando sobre ella las fibras de DNA. Una vez recuperado el máximo posible, retirar suavemente la varilla atravesando la capa de etanol. El DNA estará adherido al extremo de la varilla con un aspecto de copo de algodón mojado. Resuspender el DNA en un tubo de ensayo con 1 ml de agua. El aspecto filamentoso y la posibilidad de enrollar el DNA en la pipeta pasteur se debe a la gran longitud de las moléculas de DNA. 4. Efectos del procesado sobre la extracción Para poder aislar el DNA en forma de filamentos y obtener el ovillo es preciso mantener su integridad. Para comprobar esto se realizarán diversos tratamientos que provocan alteraciones en las fibras de DNA. Tomar 50 ml de solución de lisis y añadir 25 gr de material. Empleando la batidora homogeneizar durante 5 segundos a velocidad máxima. Dividir el homogeneizado en cuatro fracciones de 5 ml cada una. A continuación, realizar lo siguiente con cada una de las fracciones: Fracción 1 (control): Incubar 15 minutos a 55 ºC, filtrar y precipitar el DNA con 2.5 volúmenes de etanol frío. Fracción 2 (fragmentación mecánica): Homogeneizar durante 2 minutos más, incubar 15 minutos a 55 ºC, filtrar y precipitar el DNA con 2.5 volúmenes de etanol frío. Fracción 3 (desnaturalización por calor): Incubar 10 minutos a 100 ºC (a ebullición), dejar en hielo durante 10 minutos, filtrar y precipitar el DNA con 2.5 volúmenes de etanol frío. Fracción 4 (hidrólisis ácida): Incubar 15 minutos a 55 ºC, filtrar el homogeneizado, añadir 1 ml de HCl, mezclar bien e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Precipitar con 2.5 volúmenes de etanol frío. Observar las diferencias en el precipitado del DNA y la capacidad de recuperarlo en forma de ovillo.

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PRÁCTICA ADICIONAL VOLUNTARIA: ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN GELES DE AGAROSA. La electroforesis en gel de agarosa es una de las técnicas más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Los ácidos nucleicos son macromoléculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño emigran de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se utilizan marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En esta práctica se pretende comprender el fundamento teórico de esta técnica y sus aplicaciones, llevando a cabo la separación electroforética en gel de agarosa, de un DNA plasmídico que el alumno va a aislar a partir de un cultivo bacteriano, digerir con endonucleasas de restricción y, finalmente, analizar mediante electroforesis en gel de agarosa. M ATERIALES: 1. Equipamiento Centrifuga de sobremesa para tubos eppendorf. Microondas o placa calefactora. Equipo de electroforesis (cubeta, soporte, peine, fuente de alimentación). 2. Material Matraces de 100 ml. Pipetas de vidrio de 5 ml. Probetas de 100 ml y 250 ml. Micropipetas y puntas desechables. Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. 3. Reactivos Medio de cultivo LB. Solución de resuspensión de células. Solución de lisis de células. Solución de neutralización. Etanol absoluto o isopropanol. Etanol 70%. Agua destilada estéril. Tampón de electroforesis TBE (Tris-borato). Agarosa. Azul de metileno. Tampón de carga de las muestras. Marcadores de peso molecular. OBJETIVOS  Conocer los métodos de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa.   !"# " 

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 Aislamiento y purificación de plásmidos bacterianos a partir de estirpes portadoras mediante la utilización de un “Kit” casero.  Digestión del plásmido aislado con endonucleasas de restricción.  Determinación de los tamaños moleculares mediante electroforesis en gel de agarosa, haciendo una recta patrón con fragmentos de DNA de peso molecular conocido. INTRODUCCIÓN La electroforesis es una técnica de separación en la que migra a través de una matriz una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Los ácidos nucleicos presentan carga negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis los ácidos nucleicos migran hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. Las matrices más utilizadas en este procedimiento son la agarosa y la poliacrilamida. La agarosa es un polisacárido natural, obtenido a partir de algas marinas, mientras que la poliacrilamida es un polímero síntético orgánico de alto peso molecular producido a partir de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. La agarosa no polimeriza al gelificar sino que simplemente sufre un cambio de estado, por lo que la variabilidad de la polimerización de la poliacrilamida desaparece. Para formar los geles, la agarosa sólida se disuelve en un tampón (generalmente tris-borato o tris-acetato) por calentamiento. El punto de fusión de la agarosa ordinaria es próximo a los 80ºC. Sin embargo, la agarosa no gelifica hasta por debajo de los 45ºC. Para realizar la electroforesis los geles de agarosa se colocan en una cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8 (tris-borato o tris-acetato), a la que se aplica un campo eléctrico. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA se desplazarán hacia el polo positivo. Los geles de agarosa pueden considerarse dependientes del efecto tamiz de las fibras del gel, y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. El tamaño de la malla depende de la concentración de agarosa, de tal forma que una mayor concentración de azarosa produce una mayor resistencia al avance de la muestra. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño emigran de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Para poder calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema debemos utilizar marcadores de tamaño conocido que nos sirven de referencia. La muestra es incolora y transparente, por lo que para observar la muestra se emplean distintas técnicas. La más empleada actualmente es la tinción del gel con bromuro de etidio, un agente intercalante que se sitúa entre las bases del ácido nucleico y al ser iluminada con luz ultravioleta emite fluorescencia. Tras la electroforesis, se tiñe el gel y se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, viéndose las bandas correspondientes a las muestras de DNA utilizado y los marcadores de peso molecular. En esta práctica vamos a analizar DNA plasmídico previamente digerido con endonucleasas de restricción. Un plásmido es una molécula de DNA extracromosómico (que puede ser mantenida de forma estable independiente del cromosoma), circular (covalentemente cerrado) y de pequeño tamaño que se encuentra en muchas especies bacterianas, aunque también existen plásmidos en ciertos eucariotas. Se caracterizan porque se replican de manera independiente del DNA cromosómico bacteriano, tienen su propio origen de replicación, y no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero   !"# " 

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pueden contener genes que contribuyan a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos. La purificación de DNA plasmídico de bacterias implica tres pasos: a) Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora del plásmido en medio de cultivo b) Recogida y lisis de las bacterias c) Purificación del DNA plasmídico El método utilizado para la obtención de plásmido en esta práctica se denomina lisis alcalina y se basa en la desnaturalización selectiva del DNA cromosómico mediante alcalinización con NaOH y adición de SDS (un detergente), en condiciones en las que el DNA plasmídico permanece próximo a su estructura nativa, debido principalmente a su pequeño tamaño y su naturaleza circular y superenrollada. Al neutralizar e...